褪黑素對動物生殖功能的影響

毛夢菌，吳佳俊，高 倩

(衢州市衢江區畜牧獸醫站，浙江 衢州 324022)

哺乳動物卵巢中含有大量的腔前卵泡，但是在發育到有腔卵泡前大約99.9%的卵泡都走向閉鎖、退化，這無疑是動物繁殖領域內巨大的浪費。卵母細胞是體外受精、胚胎移植、動物克隆和轉基因等胚胎生物技術研究和開發不可或缺的材料，然而卵母細胞來源十分匱乏成為其發展的一個制約性因素，無疑腔前卵泡的體外培養技術為其提供了一個有效途徑。

目前，在動物卵泡體外培養實驗中僅有小鼠的原始卵泡經培養后，卵母細胞發育成熟并獲得了活體后代。在哺乳動物的研究中，有報道從腔前卵泡培養后獲得的卵母細胞成熟后發育到囊胚期，但是至今還未有獲得活體后代的報道，所以在哺乳類動物的卵泡體外培養研究中還有大量的研究工作要做。

褪黑素(MT)在生殖調控中具有重要作用，在人排卵前卵泡液中發現了高水平的褪黑素，提示有可能直接參與卵泡的生殖調控。在小鼠的次級卵泡體外培養中添加不同濃度的褪黑素，在100 μM水平的條件下觀察到雄激素和孕激素的合成量增加而雌激素的合成不受影響，試驗表明褪黑素在膜細胞類固醇激素合成過程中發揮一定的作用[1]。同樣，在豬有腔卵泡培養體系中，在10、50和100 ng/mL濃度的褪黑素以及有無最佳濃度LH的培養基中培養30 h，發現在有無LH的情況下MT都能促進孕激素的產生，在100 ng/mL時促進雄激素的生成，但在LH存在時表現為抑制作用[2]。

體內外實驗以及臨床應用表明，MT對人肝癌H22細胞、人肺癌NCIH446細胞、人黑色素瘤SBQ細胞等均有明顯的抑制作用，主要表現為抑制增殖，促進凋亡。此外還有研究表明，MT可抑制神經系統腫瘤的增殖，促進多種細胞分化及有助于幼稚細胞的分化成熟等[3]。因此，本實驗為了探尋更高質量的豬腔前卵泡培養體系，提高卵泡培養質量，也試圖探討褪黑素對卵泡發育的作用，在卵泡培養液中添加不同濃度的褪黑素，觀察褪黑素對豬腔前卵泡的體外生長發育以及細胞凋亡水平的影響。

1 褪黑素的生物學特性

褪黑素(melatonin，MT)是主要由松果體分泌的一種神經內分泌激素，分泌具有明顯的光周期性變化(晝低夜高)。褪黑素由Lerner在1958年首次在松果體中分離出來，由于其能使一種產生黑色素(melanin)的細胞發亮，因而得名。其化學結構為N-乙酰-5-甲氧基色胺，相對分子質量232.27，熔點116～118 ℃，其純品為淡黃色葉片狀結晶[4]。褪黑素的分子式為C13H16N2O2。其生物合成與年齡具有很大關系，隨年齡的增大逐漸下降。褪黑素受體屬于G-蛋白偶聯受體家族，并被分為MT1、MT2、MT3等三種亞型[5]。

2 褪黑素的分泌、合成與代謝

2.1褪黑素的分泌 哺乳動物松果體是分泌褪黑素的主要器官，除此之外，在腦區其他部位、視網膜、副淚腺、腸道、非脊椎動物(如昆蟲和單細胞藻類)體內、許多植物(核桃、香蕉、黃瓜、草莓)均含有褪黑素。褪黑素在松果體細胞合成的過程為：①色氨酸在色氨酸羥化酶(TPH)的作用下轉變成5-羥基色氨酸；②經5-羥基色氨酸脫羧酶(5-HT-POC)催化生成5-羥色胺；③在N-乙酰轉移酶(NAT)和羥基吲哚氧位甲基轉移酶(HIMOT)作用下最終轉變成褪黑素(N-乙酰-5-甲氧基色胺)。MT經松果體及其他組織合成后分泌進入血液，并經脈絡膜進入腦脊液。在褪黑素合成路徑中，NAT是褪黑素合成限速酶，HIMOT是整個合成過程中的關鍵酶。

2.2褪黑素的合成 哺乳動物的內分泌活動受光照周期的影響。光照信息通過以下途徑到達松果體：光照-視交叉-視交叉上核(SCN)-下丘腦室周區和結節區(經后腦頂蓋背側)-脊髓的胸段-脊髓節前交感神經束-頸上神經節-節后交感神經纖維-松果體的實質細胞。5-HT的濃度變化與日節律相反，即白天增多夜間急劇減少。羥基吲哚-氧-甲基轉移酶(HIO)是合成其的關鍵酶，該酶的活性在夜間黑暗條件下比白天高30～50倍。去甲腎上腺素(NE)可以使該酶活化，是通過cAMP而引起的酶蛋白合成增加所致。光照刺激可減少或抑制交感神經(SNS)釋放去甲腎上腺素，因此，光的周期性變化通過SNS而使NE的含量也呈現周期性，從而使HIO的活性、5-HT和MT的量都呈現周期性的變化。由此產生的結果是：日周期性變化和季節性周期性變化。動物MT分泌的晝夜、季節變化規律是生物與自然界環境和營養供應變化相適應的一種本能。

2.3褪黑素的代謝 褪黑素的半衰期約為10 min，肝臟是其主要的代謝器官。MT在肝微粒羥化酶的作用下，吲哚環的第6位發生羥基化，形成6-羥基-N-乙酰基-5-甲氧基色胺。所有代謝的褪黑素中，70%～80%與硫酸結合；5%與葡萄糖醛酸結合，經尿排出；20%經脫乙酰基和脫氨基形成5-甲氧基吲哚乙酸；另外有約1%的MT經尿直接排出[6]。

3 褪黑素的作用

MT是一種具有多種功能的光信號因子，同時又是一種自由基清除劑、抗氧化劑和細胞凋亡抑制劑，參與對中樞神經、內分泌、生殖、消化、免疫等系統的調節。具有高親脂性和部分的親水性，有高度彌散穿透能力，從而在細胞膜、細胞質和細胞核中都能發揮抗氧化作用。

褪黑素對生殖系統的影響根據動物的種類、生理狀況和季節環境的不同表現出促進、抑制或無作用的多重性。經研究證實：MT對人類和長日照動物如牛、鼠類、禽類等的生殖系統具有抑制作用；對于短日照動物如綿羊、鹿等動物表現為促進作用；而對于光不敏感動物則無作用[7-9]。

MT通過兩條途徑影響生殖系統：一是與卵巢、睪丸和腎上腺細胞的-腎上腺受體結合直接調節性腺激素的合成和分泌，進而控制生殖器官的發育與成熟；另一途徑是通過抑制下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸功能來影響生殖系統，在下丘腦水平上調節促性腺激素的分泌[10]。

在人類的研究中表明，血液中高水平的MT伴隨著促黃體素(LH)的釋放增加[11]。在對婦女進行外源性褪黑素添加處理時可以增加LH釋放的脈沖幅度[12],證實MT在調控LH釋放中的功能。培養人的顆粒細胞實驗表明當用MT處理時LH受體mRNA水平上調[13]。Li等(1997年)在對雄性大鼠的研究中發現MT對促性腺激素釋放激素(GnRH)有正性作用。MT對綿羊的GnRH/LH系統有明顯的影響作用。當秋季日照逐漸縮短時，MT的分泌逐漸增加，進而導致母羊生殖內分泌活動加強。

MT除對GnRH/LH系統的調控作用外，對催乳素(PRL)的分泌也有顯著的影響。將山羊飼養在人工控制的日照時間為16 h的室內，每日在天黑前飼喂MT，連續飼喂23 d后，檢測發現血液中PRL含量下降大約50%[14]。

在豬卵泡體外培養實驗研究中得出，MT在膜細胞中通過類固醇激素合成酶基因的表達影響性腺激素的生物合成[15]。在體外培養的人顆粒黃體細胞中添加生理濃度的MT(200 pg/mL)能顯著增加孕激素的產量[16]。

研究證實在男性的下丘腦視上核、垂體前葉腺結節及睪丸等部位均有MT受體的存在[17]。在對雄性大鼠的研究中發現MT可對GnRH有促進作用，在成年大鼠中給予切除松果體3周后GnRH濃度下降35%，而在注射MT 4 h后，GnRH mRNA的濃度增加了15%，從而表明MT對GnRH基因有激活作用。

MT與PRL、LH、FSH等之間有特殊的關系，對后者具有重要的調節作用。在對短光照、黑暗、致盲倉鼠激素水平的研究表明，垂體分泌的三種激素水平下降，以PRL下降最為明顯，特別是在性腺萎縮以前更明顯。外源性MT對生殖功能的調節作用與動物的年齡大小、給予褪黑素的時間長短、光照周期及月經周期等因素有關。MT可使卵巢、子宮萎縮，抑制下丘腦促性腺激素釋放，延緩未成年動物的性成熟，降低促性腺激素的誘發排卵效應和阻斷絨毛膜促性腺激素引起的排卵與子宮增重反應，縮短黃體壽命、降低孕酮含量，其作用的機理有實驗研究表明為通過下丘腦-垂體-性腺軸發揮抑制作用[18]。也有文獻報道發現了雌性動物卵巢中MT受體的存在，從而說明MT很有可能也可以直接作用于卵巢來發揮作用[19]。

Ianas等首先證實MT是一種抗氧化劑，主要清除羥自由基(-OH)，一分子的MT可以清除二分子的-OH和H2O2[20]。MT除了能直接清除-OH外，還具有比維生素E更有效的清除多聚不飽和脂肪酸(PUFA)氧化過程中產生的過氧化自由基LOO-的作用。MT的高度脂溶性，使其廣泛分布于細胞膜中，并能插入細胞膜中脂肪酸的極性頭部之間。這種作用被認為是MT保護細胞膜抵抗氧化應激的另一種方式。MT具有膜受體和核受體，因此能與細胞核接近而清除DNA附近的ROS。MT還能通過激活DNA的修復機制，使DNA免遭各種ROS引起的損傷。MT是目前已知的抗氧化作用最強的內源性自由基清除劑，其自由基清除能力是維生素E的2倍、谷胱甘肽的4倍、甘露醇的14倍[21]。

研究表明：MT是一種非酶類抗氧化劑，可以從兩個方面發揮抗氧化作用，其分別為：一是可以與自由基結合，阻止自由基氧化的連鎖反應；二是減少自由基的產生。

動物機體內伴隨著酶促反應和非酶促反應可以產生自由基，后者包括氧自由基、羥自由基、過氧自由基和單氧自由基等。MT可以及時的清除產生的自由基[22]。其清除的機制可能有：1.通過向缺電子自由基供給電子及清除負電子O2-,從而為生物大分子提供有效的抗氧化保護；2.MT代謝產物級聯抗氧化作用；3.通過調節抗氧化酶的表達間接發揮抗氧化作用[23]。