丹酚酸B 通過下調細胞凋亡及炎性損傷減輕高糖誘導的RSC96 細胞損傷*

王倩倩，孫連慶

西安交通大學第一附屬醫院,陜西 西安710061

糖尿病周圍神經病變是糖尿病患者出現神經功能障礙體征或癥狀的一類并發癥，主要表現為感覺、運動功能障礙，嚴重影響患者的生活質量［1-4］。但目前有關糖尿病周圍神經病變的發病機制尚未闡明，尚缺乏有效的治療手段。丹酚酸B（salvianolic acid B，Sal B）是丹參的有效水溶性成分，具有抗氧化、清除自由基、抗凋亡、抗炎等作用［5-10］。本研究通過離體實驗觀察Sal B 對HG 培養的雪旺細胞增殖活性、凋亡及炎性因子表達的影響，探討Sal B 是否通過抑制細胞凋亡及炎性損傷對糖尿病周圍神經病變起到防治作用。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞大鼠雪旺細胞系細胞（rat schwann cell line，RSC96）是一種永生化的大鼠雪旺細胞，購自美國模式培養物集存庫ATCC，由陜西藩勝生物科技有限公司上海辦代為采買。

1.2 藥品及試劑D-葡萄糖、Sal B、噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（Sigma，美國）；低糖培養基、HG 培養基（Hyclone，美國），Annexin V-FITC（七海生物，中國）；活性氧（reactive oxygen species，ROS）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，中國）；兔抗大鼠Bax，Bcl-2，P65，抗體（CST，美國）；白細胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）（Immunoway，中國）。

1.3 實驗儀器CO2培養箱（上海普美達儀器有限公司，中國）；倒置相差顯微鏡（olympus，日本）；臺式高速離心機（蘇州華宇凈化設備有限公司，中國）；酶標儀（BioTek，美國）；流式細胞儀（BD Biosciences公司，美國）。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養及傳代 復蘇RSC96 細胞，加入DMEM培養基、胎牛血清（10%）、雙抗，2～3天換液1次。待細胞長至瓶底80%～90%，用2.5 g/L 胰蛋白酶消化，3～5 天傳代一次，取對數生長期細胞進行實驗。

1.4.2 MTT 比色法檢測OD 值 按照2000/孔的密度將RSC96細胞接種于96孔板，加入不同濃度HG培養基（5.6、25、50、75、100、125 mmol/L）及Sal B 1 μmol/L 作用72 h，每孔避光加入20 μL MTT 溶液，繼續孵育4 h，終止培養，吸棄孔內培養上清液，每孔避光加入150 μL DMSO，避光振蕩10 min，于酶聯免疫檢測儀選擇490 nm波長測定各孔光吸收值（OD值）。

1.4.3 流式檢測ROS 按照5×104/孔的密度接種于6 孔板，將實驗分為低糖組（5.6 mmol/L），HG組（125 mmol/L），HG+Sal B 組（HG 125mmol/L+SalB 1 μmol/L），作用70 h，加入DCFH-DA 10 μmol/L，作用2 h，胰酶消化并收集細胞于流式機按照激發波長485 nm，發射波長525 nm 檢測活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平。

1.4.4 Western blot 檢測凋亡及凋亡相關蛋白的表達 加入不同條件作用72 h，各組細胞標本加入細胞裂解液提取蛋白，將含有40 μg 蛋白上清液電泳分離，并轉移到硝酸纖維素膜上，并將含5%脫脂奶粉進行封閉，一抗Bax（BCL2-Associated X，Bax），B 細胞淋巴瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2），核因子κB P65（nuclear transcription factor kappaBP65，NF-κB-P65），IL-1β過夜孵育，TBST 洗膜3 次，二抗孵育1 h，采用ECL試劑盒檢測，采用Image-pro圖像分析定量。

1.5 統計學方法采用SPSS 18.0統計軟件進行數據統計，計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析，非正態分析數據采用非參數檢驗方法，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 OD值各組OD值隨著糖濃度的增加而降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組OD值比較（±s）

表1 各組OD值比較（±s）

注：*表示與正常對照組比較，P＜0.05

組別對照組次數HG組OD值0.6656±0.0407 0.6472±0.0247 0.6054±0.0230 0.6582±0.0433 0.5782±0.0385*0.5196±0.0363*3 3 3 3 3 3 GS劑量（mmol/L）5.6 25 50 75 100 125

2.2 細胞增殖活力的抑制隨著丹酚酸濃度的升高，丹酚酸B促進細胞增殖作用越明顯。見表2。

2.3 ROS 含量HG 組與對照組比較，ROS 含量明顯增加；HG+Sal B 中劑量組（HG 125 mmol/L+SalB 1 μmol/L）與HG組比較，ROS含量明顯下降（P＜0.05）。見圖1。

2.4 細胞凋亡及炎性相關蛋白的表達與對照組比較，HG組Bax、P65、IL-1β表達水平表達上升，Bcl-2 表達水平下調（P＜0.05）；與HG 組比較，HG+Sal B 中劑量組Bax、P65、IL-1β 表達水平下降，Bcl-2表達水平上調（P＜0.05）。見圖2。

表2 各組對細胞增殖活力的影響（±s）

表2 各組對細胞增殖活力的影響（±s）

注：*表示與HG組比較，P＜0.05

分組對照組HG組HG+SalB高劑量組HG+SalB中劑量組HG+SalB低劑量組細胞增殖活力0.6670±0.0590 0.5876±0.4930 1.9870±0.0480*1.3982±0.0425*0.9832±0.0520*次數3 3 3 3 3劑量GS 5.6 mmol/L GS 125 mmol/L GS 125 mmol/L+SalB 10 μmol/L GS 125 mmol/L+SalB 1 μmol/L GS 125 mmol/L+SalB 0.1 μmol/L

圖1 各組ROS含量

圖2 各組凋亡及炎性相關蛋白的表達

3 討論

氧化應激是糖尿病周圍神經病變的重要發病機制，而HG 刺激是誘發細胞活性氧過量產生的重要原因。當周圍神經組織暴露在HG 環境中時，葡萄糖順濃度梯度轉運到神經細胞內部，細胞內長期、慢性高血糖狀態將導致氧化和抗氧化系統失衡。線粒體是ROS 的重要靶器官，而神經組織中線粒體含量豐富，因此，由氧化應激損傷造成的神經元和神經膠質細胞的凋亡最終可能導致DPN 的發生［10-11］。HG 可誘導氧化應激導致ROS 的累積。ROS 在炎性反應過程中發揮重要作用。ROS 可誘導線粒體通透孔開放，導致線粒體膜電位下降，并釋放細胞色素C，繼而激活NF-kB 等炎性信號通路，誘發炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-18 的合成、釋放，最終引起細胞損傷。

Sal B是丹參的主要藥用成分之一，由三分子的丹參素和一分子的咖啡酸縮合而成。研究發現，Sal B可通過抗氧化活性緩解高脂飲食和鏈脲佐菌素誘導的2型糖尿病大鼠癥狀［12］；同時，Sal B可阻斷神經元內氧化應激和線粒體障礙，對神經系統具有保護作用［13］。因此，我們推測Sal B可能通過抑制ROS 介導的細胞凋亡及炎性損傷保護周圍神經。鑒于此，我們采用MTT 法檢測細胞增殖活性，結果發現隨著糖濃度的提高，RSC96 細胞增殖活性降低。繼而檢測了不同濃度Sal B 對HG 培養的RSC96 細胞增殖的影響，結果發現隨著Sal B濃度的增加，RSC96 細胞增殖活性增加。采用流式法檢測ROS 含量，結果發現高濃度葡萄糖可上調ROS，Sal B 可下調ROS；采用免疫印跡法檢測凋亡、炎性因子相關蛋白的表達，結果發現HG 可增加凋亡、炎性因子相關蛋白的表達，Sal B 可減少凋亡及炎性因子相關蛋白的表達水平。

綜上所述，Sal B 可通過抑制ROS 介導的細胞凋亡及炎性因子的表達保護周圍神經。但目前有關Sal B 作用于動物模型及人體的實驗尚待進一步研究。在今后的工作中可進一步研究印證Sal B對糖尿病周圍神經病變保護作用。