生、熟大黃對(duì)大承氣湯瀉下作用的比較研究*

曾海生，周歧驥，覃洪含，郭小葆，林 瑤，何思陸△

1 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色533000；2 右江民族醫(yī)學(xué)院

大黃屬中藥瀉下藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。大黃為唐古特大黃Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.、蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.或藥用大黃Rheum officinaleBaill.的干燥根和根莖［1］。大承氣湯始載于漢代張仲景的《傷寒論雜病論》，由大黃、枳實(shí)、厚樸和芒硝組成，是瀉法的代表方劑［2］，具有瀉下熱結(jié)的作用，主治陽明腑實(shí)證和里熱實(shí)證等［3］。目前臨床上主要用于治療急腹癥、腸梗阻與胃腸道功能障礙等疾病。研究表明，該方還具有抑制血清內(nèi)毒素、降低炎性細(xì)胞因子水平、提高機(jī)體免疫力和調(diào)節(jié)胃腸激素分泌等作用，對(duì)腦、肺等臟器具有明顯的保護(hù)作用［4-10］。大承氣湯中大黃的瀉下活性成分為蒽醌類成分，以游離型與結(jié)合型兩種形式存在［11-14］。有文獻(xiàn)報(bào)道［15-18］，不同煎煮方法和煎煮時(shí)間對(duì)大黃及大承氣湯中蒽醌類成分的溶出量有顯著的影響，且能影響其藥效。本研究旨在探討大黃不同炮制品對(duì)大承氣湯瀉下作用的影響，為臨床合理使用生熟大黃提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物72 只清潔級(jí)昆明小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：0001757，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK 桂2014-0002，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥物及試劑生大黃、枳實(shí)、厚樸及芒硝購于廣東康美藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室李斌副教授鑒定，大黃為蓼科植物藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根和根莖，枳實(shí)為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.的干燥幼果，厚樸為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalis Rehd.et Wils.或凹葉厚樸Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮。以上三味中藥粉碎過10 目篩。芒硝，中藥名，經(jīng)鑒定為硫酸鹽類礦物芒硝族芒硝，為結(jié)晶體，主要含十水硫酸鈉（Na2SO4·10H2O）。酚酞片（山西亨瑞達(dá)制藥有限公司，批號(hào)：160702）；超微量Na+-K+-ATP 酶試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20170322）；考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20170218）；生理鹽水（辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：1610060721）；試驗(yàn)用水為純水。見表1。

表1 藥材批號(hào)與產(chǎn)地

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器UV-1800 型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；20110793 型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國，BIOTEK-Epoch）；PYX-190H-B 型育溫箱（廣東科力有限公司）；ZH-B6 型代謝籠（安徽正華有限公司）；41284881 型離心機(jī)（德國，Thermo Fisher）；HWS12型水浴鍋（上海一恒公司）等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 藥液提取 采用上述藥材，按處方比例取厚樸藥材粉末24 g，枳實(shí)12 g，大黃12 g，芒硝9 g，分別精密稱定，厚樸與枳實(shí)加純水500 mL，浸泡30 min 后，加熱煮沸后保持微沸30 min，使用500目濾布過濾，剩下的藥渣再加純水500 mL后，浸泡30 min，然后加熱煮沸保持微沸30 min，再過濾，合并兩次濾液，然后加入大黃粉末，浸泡20 min后，再加熱煮沸，保持微沸20 min，使用500 目濾布過濾，藥渣再加入純水300 mL，加熱煮沸后保持微沸20 min，濾過，合并濾液，趁熱加入芒硝，攪拌使溶解，濃縮成濃度為0.3∶1的藥液（含生藥0.3 g/mL），置于2～8℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

同“1.4.1”項(xiàng)制備藥液方法，將藥液濃縮成濃度為0.5∶1的藥液（含生藥0.5 g/mL），置于2～8℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 分組及給藥 將健康昆明小鼠72 只適應(yīng)性喂養(yǎng)3 天后，隨機(jī)分為：生大黃大承氣湯組（生DCQ 組）低（6 g/kg 灌胃）、高（10 g/kg 灌胃）劑量組，熟大黃大承氣湯組（熟DCQ 組）低（6 g/kg 灌胃）、高（10 g/kg 灌胃）劑量組，陽性對(duì)照組（酚酞片60 mg/kg灌胃），空白對(duì)照組（等量蒸餾水灌胃）共6組，每組12只。

1.4.3 小鼠瀉下指標(biāo)觀察［19-20］實(shí)驗(yàn)當(dāng)日小鼠禁食不禁水4 h，空白組蒸餾水灌胃，其余組均給予對(duì)應(yīng)的給藥劑量（6 g/kg、10 g/kg），容積20 mL/kg。然后將實(shí)驗(yàn)小鼠單獨(dú)放入代謝籠中（底下鋪有濾紙），然后觀察瀉下情況，按糞便性狀分為：水便、溏便、軟便、正常。水便和溏便為瀉下，分別觀察5 h 內(nèi)各組小鼠的瀉下只數(shù)、首次瀉下時(shí)間、瀉下總次數(shù)和總排便次數(shù)，比較生大黃與熟大黃的大承氣湯對(duì)正常小鼠排便的影響差異性。

1.4.4 小鼠腸道炭末推進(jìn)率［21］按“1.4.2”項(xiàng)下的方法分組，各組分別給予上述加入墨汁的藥液灌胃給藥，16 min 后脫頸椎處死，解剖開腹，取出從幽門到回盲部的小腸（盲腸前端），按不加牽引地平鋪于干凈的玻璃板上，測(cè)量其全長(zhǎng)和炭末前沿到幽門的距離，計(jì)算其與全長(zhǎng)的百分比。

炭末推進(jìn)率=炭末在腸內(nèi)推進(jìn)距離（cm）/小腸全長(zhǎng)（cm）×100%

1.4.5 小鼠結(jié)腸壁細(xì)胞Na+-K+-ATPase活性［22-23］按“1.4.2”項(xiàng)下的方法分組給藥，連續(xù)灌胃給藥6天，第6 天灌胃給藥30 min 后頸椎脫臼處死，馬上從回盲部下端剪取結(jié)腸，下列實(shí)驗(yàn)操作都在冰水環(huán)境中進(jìn)行，用預(yù)冷的蒸餾水反復(fù)清洗腸腔內(nèi)外血液和糞便，用濾紙稍微吸干，精確稱取0.2 g，然后加入生理鹽水1.8 mL，使用勻漿機(jī)，制備成10%質(zhì)量濃度比的勻漿液，2500 r/min，離心10 min，取上清液0.2 mL 加入0.8 mL 生理鹽水稀釋成2%體積比的勻漿，所得勻漿液在595 nm處，使用超微量Na+-K+-ATPase 試劑盒和考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒測(cè)定其吸光度A，并計(jì)算樣本的蛋白濃度和ATPase活力。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瀉下指標(biāo)首次瀉下時(shí)間、瀉下次數(shù)、總排便次數(shù)陽性對(duì)照組，生DCQ組低、高劑量組，熟DCQ組低、高劑量組均高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中以生DCQ 組高劑量組顯著。首次瀉下時(shí)間、瀉下次數(shù)、總排便次數(shù)熟DCQ 組低、高劑量組均低于生DCQ 同劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中以熟DCQ 組高劑量組顯著。見表2。

表2 各組小鼠瀉下指標(biāo)比較（±s）

表2 各組小鼠瀉下指標(biāo)比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與生DCQ同劑量組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01；-表示無數(shù)值

5 h內(nèi)總排便次數(shù)（次）9.42±1.18**12.54±1.89**7.68±1.75**△△9.72±1.96**△△11.73±2.01*4.08±1.67△△組別生DCQ組低劑量組生DCQ組高劑量組熟DCQ組低劑量組熟DCQ組高劑量組陽性對(duì)照組空白對(duì)照組鼠數(shù)12 12 12 12 12 12首次瀉下時(shí)間（min）83.28±7.12**59.07±5.81**105.32±15.64**△△79.43±16.49**△△63.06±8.25**-5 h內(nèi)瀉下次數(shù)（次）8.96±1.99**9.63±2.78**6.91±1.25**△△7.86±1.87**△△9.32±2.56**-

2.2 小鼠腸道炭末推進(jìn)率及Na+-K+-ATPase 活性炭末推進(jìn)率陽性對(duì)照組，生DCQ 組低、高劑量組，熟DCQ 組低、高劑量組均高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；炭末推進(jìn)率熟DCQ低、高劑量組炭組均低于生DCQ 同劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Na+-K+-ATP 酶活力陽性對(duì)照組，生DCQ 組低、高劑量組，熟DCQ 組低、高劑量組均低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；ATP酶活力熟DCQ低、高劑量組炭組均低于生DCQ 同劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠炭末推進(jìn)率及Na+-K+-ATPase活力比較（±s）

表3 各組小鼠炭末推進(jìn)率及Na+-K+-ATPase活力比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與生DCQ同劑量組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

Na+-K+-ATPase活性（U·mg-1prot）1.49±0.85**1.18±0.37**1.77±0.54**△1.59±0.26**△△1.61±0.43**2.82±0.37△△組別生DCQ組低劑量組生DCQ組高劑量組熟DCQ組低劑量組熟DCQ組高劑量組陽性對(duì)照組空白對(duì)照組鼠數(shù)12 12 12 12 12 12炭末推進(jìn)率（%）79.12±3.61**87.06±3.71**72.13±4.73**△△80.93±3.32**△77.92±5.13**38.61±5.94△△

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選用經(jīng)典研究方法，觀察實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)小鼠瀉下作用、炭末推進(jìn)率及Na+-K+-ATPase 活性的影響。通過與空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組及生、熟大黃的大承氣湯組進(jìn)行比較，探討生、熟大黃的大承氣湯的瀉下作用變化差異，為大黃不同炮制品對(duì)大承氣湯影響的物質(zhì)基礎(chǔ)的研究奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)［24］與結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)確定給藥劑量；酚酞為常用瀉藥，是臨床上常用于治療便秘的藥，能用于正常瀉下之用，故本試驗(yàn)選擇使用酚酞作為陽性藥。

分別使用生、熟大黃的大承氣湯其瀉下作用總體上雖有一定的差異性，但其變化在一定程度上與大黃的不同炮制品對(duì)其方劑的影響存在著某些關(guān)系。生DCQ組、熟DCQ組與空白對(duì)照組及陽性對(duì)照組比較，其對(duì)正常小鼠正常瀉下作用、炭末推進(jìn)作用、抑制Na+-K+-ATPase 活性的作用有差異性。有文獻(xiàn)報(bào)道［25］，大承氣湯的瀉下功效與總蒽醌成分有關(guān)，與空白對(duì)照組比較，使用生、熟大黃的大承氣湯對(duì)正常小鼠瀉下作用、炭末推進(jìn)功能和Na+-K+-ATPase活性抑制率都具顯著性。

大黃不同炮制品在經(jīng)典組方“大承氣湯”中所起到瀉下功效變化的相關(guān)效應(yīng)，這些變化可能與生大黃和熟大黃的化學(xué)成分含量的轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)化有關(guān)，在某些方面上具有一定的聯(lián)系和規(guī)律，至于生大黃與熟大黃對(duì)大承氣湯在人體內(nèi)這些變化是否會(huì)改變，有待進(jìn)一步研究探索。

中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)極其復(fù)雜，其化學(xué)成分有黃酮類、酚酸類、皂苷類、生物堿、鞣質(zhì)等及蛋白質(zhì)、多糖、無機(jī)元素等。目前，中藥方劑配伍的化學(xué)成分的研究，大體上是在配伍前后方劑中個(gè)別化學(xué)成分的定量分析、方劑配伍后成分的含量變化及配伍后多成分定量分析研究［26-33］，而想在中藥方劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)上有所突破，就要沖破目前研究方劑所固有的方法和思維模式，需要有創(chuàng)新性的方法和思維及深入的研究。