抗纖靈對慢性腎功能衰竭模型Smad2-KO小鼠心臟CoI、CoIII、AngII、TNF-α、IL-6 的影響*

夏 嘉，王 穎，劉銘潔，高雅嬋，陳文浩，何立群△

1 上海中醫藥大學附屬市中醫醫院，上海200071；2 上海中醫藥大學附屬中西醫結合醫院；3 貴陽中醫學院第一附屬醫院；4 上海中醫藥大學附屬曙光醫院

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是指在各種致病因素影響下產生持續三個月或三個月以上的腎臟結構和功能的改變，是現今發病率較高的一種疾病。如果CKD 不能被早發現、早治療將很快進展至慢性腎功能衰竭（chro-nic renal failure，CRF），若腎單位和腎功能持續進行性喪失，會引發心血管并發癥，嚴重危害人類健康。即便在CKD 早期，心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的患病率和死亡風險已明顯增加，有的患者在進入終末期腎病之前就已死于CVD［1］。故而如何有效防治CKD 引起的CVD，減少全因死亡率，已逐漸成為近年來全球性的重要醫療課題。Smad2 基因作為TGFβ1/Smad 通路的重要成員，對心、腎纖維化起著不可忽視的作用。本研究旨在觀察抗纖靈對Smad2-KO的CRF小鼠心臟病變的影響，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇59 只SPF 級腎臟上皮細胞Smad2-KO 小鼠，體質量18～21 g，種鼠來自美國JACKSON實驗室，由上海南方模式生物研究中心培育繁殖并分籠飼養，實驗動物合格證號：SCXK（滬）2014-0002，小鼠在室溫26℃、相對濕度45%、人工12 h晝/夜循環照明環境中自由進食飼料和飲水。

1.2 實驗藥物抗纖靈藥物組成：桃仁12 g，丹參15 g，當歸12 g，酒大黃9 g，懷牛膝15 g，由曙光醫院中藥房提供，煎煮20～25 min。纈沙坦膠囊（北京諾華制藥有限公司，國藥準字號H20040217，規格：80 mg/粒）。

1.3 儀器與試劑AngII 酶聯免疫吸附試劑盒（武漢華美生物有限公司，批號：G11099685）；BCA蛋白定量試劑盒、兔抗小鼠CoⅠ、CoⅢ、TNF-α、IL-6多克隆抗體及二抗HRP標記的IgG（武漢博士德生物技術公司，批號：24561、53940、78326、10517、81109、17813）；Mini Protean Cell 垂直電泳儀和轉膜儀（美國伯樂Bio-Rad 公司）；PVDF膜（美國Millipore 公司）；X 射線膠片（美國柯達公司）；Multiskan Ex 型酶標儀（上?？埔纳锛夹g有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模及分組 1）假手術方法：打開腎區皮膚肌肉并暴露腎臟后再縫合傷口。將18 只假手術Smad2-KO 小鼠隨機分為假手術組、抗纖靈假手術組、纈沙坦假手術組，每組6 只。2）CRF 小鼠造模方法采用國際公認的5/6 腎臟切除手術進行（platt法）。41只Smad2-KO小鼠在第一次造模至造模2周測定血肌酐之前共死亡17只。造模成功標準：2 周后小鼠眼眶取血測肌酐，若結果高于假手術組（P＜0.05）判定為造模成功，結果造模成功24 只。將24 只CRF 模型Smad2-KO 小鼠隨機分為模型組、抗纖靈模型組、纈沙坦模型組，每組8只。

1.4.2 給藥方法 根據動物實驗中小鼠與人的體質量計算比例，按照20 g/kg把抗纖靈復方配成水煎劑，灌胃前用蒸餾水將藥液稀釋成相應的比例，抗纖靈假手術組、抗纖靈模型組小鼠分別予抗纖靈復方0.5 mL，每天灌胃。纈沙坦假手術組、纈沙坦模型組按照纈沙坦的劑量為20 mg/kg配制成混懸液，每天予0.5 mL纈沙坦灌胃。模型組、假手術組小鼠則每天分別予0.5 mL蒸餾水灌胃。

1.4.3 取材 六組小鼠灌胃8 周后取材。至實驗結束時，假手術各組Smad2-KO 小鼠未見死亡，模型組、抗纖靈模型組、纈沙坦模型組各有2 只小鼠死亡。各組小鼠眼球摘除取血后，迅速剪開胸廓，取心臟，生理鹽水洗凈，吸干多余水分，剪取一部分左心室放入4%多聚甲醛中行HE染色，剩余部分心臟放入冷存管，存放于-80℃冰箱備用。

1.5 小鼠心臟AngⅡ的表達從-80℃度冰箱中取出心臟組織并加9倍的PBS，在冰水浴中用玻璃研磨器研制成10%的勻漿，以離心半徑：13.5 cm，3500 r/min，離心10 min，取上清液，根據血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ）的Elisa 試劑盒說明書步驟操作。

1.6 小鼠心臟CoⅠ、CoⅢ、TNF-α、IL-6的表達采用免疫印跡（Western blot）法測定I 型膠原（collagen I，CoI）、Ⅲ型膠原（collagen Ⅲ，CoⅢ）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、白細胞介素6（Interleukin-6，IL-6）的蛋白表達。-80℃低溫保存的心臟組織約20 mg，加入200 mL RIPA裂解液，勻漿研碎，離心半徑：16 cm，10 000 r/min，離心5 min，離心取上清，BCA 法測定蛋白濃度，制成含蛋白量相等的上樣液，行SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳。然后將蛋白電轉到PVDF 膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS 封閉，加入一抗，4℃孵育過夜；然后TBST 洗膜5 min，3 次，加入HRP 標記的二抗室溫下搖床上孵育2 h；TBST 洗膜15 min，5次，按化學發光檢測試劑盒說明書顯影、定影，用Photo shop 測定各蛋白的相對光密度值（目的條帶灰度/內參條帶灰度）。

1.7 統計學方法采用SPSS 13.0 軟件進行統計學處理，計量資料以（±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗或Tamhane，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠心臟HE 染色假手術組、纈沙坦假手術組、抗纖靈假手術組的心肌細胞結構均正常，心肌排列整齊。模型組可見心肌細胞肥大，心肌排列紊亂、間質結締組織增生；抗纖靈模型組、纈沙坦模型組心肌細胞肥大、排列紊亂及間質結締組織增生的情況均較模型組減輕；纈沙坦模型組心肌細胞肥大改善更明顯。見圖1。

2.2 小鼠心臟CoⅠ、CoⅢ、TNF-α 及IL-6 相對表達量Smad2-KO 小鼠假手術組、纈沙坦假手術組、抗纖靈假手術組組間比較，CoⅠ、CoⅢ、TNF-α、IL-6的相對表達量差異無統計學意義（P＞0.05）；模型組與假手術組比較，Smad2-KO 小鼠模型組的CoⅠ、CoⅢ、TNF-α 及IL-6 的相對表達量明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01）；治療后，抗纖靈模型組與纈沙坦模型組均能明顯改善Smad2-KO小鼠CoⅠ、CoⅢ、TNF-α 及IL-6 的相對表達量，差異有統計學意義（P＜0.01），且兩組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1，圖2—3。

2.3 小鼠心臟AngⅡ含量與假手術組比較，抗纖靈假手術組的AngⅡ無顯著變化（P＞0.05），纈沙坦假手術組的AngⅡ下降（P＜0.05），模型組小鼠的AngⅡ含量則明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，抗纖靈模型組能改善Smad2-KO小鼠心臟AngⅡ的含量（P＜0.05），纈沙坦模型組能明顯改善Smad2-KO 小鼠心臟AngII 的含量（P＜0.01），纈沙坦模型組在改善AngII 方面優于抗纖靈模型組（P＜0.05）。見表1。

圖1 各組小鼠心臟HE染色結果（HE×400）

表1 各組Smad2-KO小鼠心臟CoI、CoIII、TNF-α、IL-6的相對表達量及AngⅡ含量比較（χ±s）

圖2 Smad2-KO小鼠心臟CoⅠ、CoⅢ的相對表達量

圖3 Smad2-KO小鼠心臟TNF-α、IL-6相對表達量

3 討論

對中醫而言，“虛”是CRF 引起CVD 的總病機，與心、脾、腎三臟相關，病理因素多涉及瘀血、濕濁、毒邪等。上海市名中醫何立群教授認為：CRF的中醫發病機制的根本在于久病及腎、久病多虛，而久病入絡、久病必瘀乃本病的標實之所系。血液動力學的改變、凝血機制的激活、纖溶系統以及體液和交感神經系統的異常等都可導致血流不暢、瘀血內生，從而引起或加重心室重構的發生發展。據此，何教授提出了活血化瘀、補腎通絡為主治療本病的原則并創立了抗纖靈復方。

Smad2 蛋白同Smad3 蛋白相類似，Smad2 被認為是TGF-β 誘導的血管平滑肌細胞轉錄因子的特定前體，它決定了血管平滑肌細胞是來源于中胚層或來源于神經脊細胞的生理上差異［2-3］。Smad3是導致腎臟炎癥和纖維化的關鍵因子，Smad2 和Smad7 則具有腎臟保護作用，Smad2 可能通過競爭性地抑制Smad3 磷酸化和核轉錄起到抗腎臟纖維化的作用。腎臟Smad2基因的缺失增加了TGF-β1/Smad3 介導的膠原基質的表達和其它諸如腎素、AngⅡ、ACE等致纖維化因子［4-5］。通過多個動物實驗，我們發現抗纖靈能抑制野生型和Smad2-KO 的CRF 模型小鼠腎組織RAS 及TGF-β1/Smad 通路的過度表達，減少細胞外基質的積聚，抑制膠原纖維的增生，具有改善腎纖維化、保護腎功能的作用［6-7］。那么抗纖靈對于腎上皮細胞Smad2-KO小鼠的CRF心室重構是否仍有作用，本研究結果顯示腎上皮細胞Smad2-KO 小鼠本身并沒有心臟結構的變化，需進行platt 法造模后才會出現心室重構。對CRF 小鼠誘導的心室重構模型進行中藥干預后，抗纖靈能改善Smad2-KO 的CRF 小鼠心肌細胞肥大、排列紊亂及間質結締組織增生的情況，并能降低心臟CoⅠ、CoⅢ、AngⅡ、TNF-α 和IL-6 的表達，起到改善心室重構的作用。

抗纖靈組成中丹參在藥理學上具有降低血黏度、改善血液流變學、抗血管硬化［8］及抗菌消炎、減輕心臟負荷、保護心肌細胞［9］、抗心律失常和抗氧化等方面的作用［10］。劉文舉等［11］用丹參酮ⅡA治療心腎綜合征患者，得出該藥可改善心腎綜合征患者全身炎癥狀態，降低血漿CRP、IL-6、TNF-α的水平，改善心腎功能的結論。大黃則有一定的強心、降血壓的作用［12］。秦志平［13］證實大黃水煎劑可改善心力衰竭患者的心功能、逆轉心室重構，又可降低左心衰大鼠的BNP 并抑制其心臟擴大、提高收縮力。池雪林等［14］報道，隨著牛膝多糖用藥濃度的增加牛蛙心肌收縮能力也隨之增強，二者的量效關系明顯。當歸可以抗心律失常、抑制心肌細胞肥大［15-16］和降低血壓，其降壓作用可能通過抑制AT1R 基因的表達和調節ERK1/2 的通路實現［17］。本研究結果表明，抗纖靈改善Smad2-KO CRF 小鼠心室重構的機制可能與降低心臟CoⅠ、CoⅢ、AngⅡ和炎癥因子的表達有關。