治療前血漿和全血干血斑樣品HIV-1 Pol區(qū)基因型耐藥檢測結(jié)果比較*

蔡曉莉，范慶紅，蘭 蕓，李麗雅，王瑾琳，陳偉烈

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第八人民醫(yī)院傳染病研究所，廣東廣州 510000

獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)是因人類免疫缺陷病毒(HIV)感染導(dǎo)致的機(jī)體免疫系統(tǒng)遭到破壞，造成許多伺機(jī)性疾病的攻擊，促成多種臨床癥狀的一種綜合癥狀[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球總計(jì)有3 690萬AIDS存活者，然而在2017年全球仍有94萬人死于AIDS相關(guān)疾病，新發(fā)感染病例仍達(dá)180萬左右；我國AIDS疫情形勢嚴(yán)峻，感染人數(shù)呈緩慢上升趨勢，截至2018年底存活感染者約125萬，全人群感染率約為9/10 000[2-3]。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART)，即雞尾酒療法，是目前治療和緩解HIV感染最有效的方式[4]。我國從2003年開始推廣免費(fèi)的抗病毒治療方案，使AIDS患者的病死率顯著下降，生活質(zhì)量顯著提升。隨著抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(ART)的推廣，藥物壓力逐漸升高，一方面由于長期服藥的不良反應(yīng)，患者依從性下降，最重要的是，HIV自身的高度變異性導(dǎo)致HIV耐藥問題日趨嚴(yán)重，治療效果不佳。因此，建立耐藥基因的人群篩查工作刻不容緩。目前關(guān)于HIV的耐藥檢測，主要是針對HIV-1建立的基因型耐藥檢測和表型耐藥檢測兩種方式，在國內(nèi)主要應(yīng)用基因型分析方法來進(jìn)行耐藥性監(jiān)測。

基因型耐藥檢測的樣品主要來自HIV-1感染者的血漿或全血，但是對于一些實(shí)驗(yàn)室條件較差的地區(qū)醫(yī)院，全血或血漿樣品在采集、分離、保存和運(yùn)輸過程中不可避免地會(huì)遇到一些難題，HIV感染者全血或血漿樣品屬于危險(xiǎn)生物制品，需專人看護(hù)、冷鏈運(yùn)輸。全血干血斑(DBS)樣品在一定程度上可以解決血漿或全血樣品在采集、保存和運(yùn)輸上存在的問題，為貧困地區(qū)監(jiān)測HIV-1耐藥性提供便利[5]。但是，由于DBS樣品承載的樣品量有限，其檢測靈敏度較血漿或全血樣品低。本研究采集了治療前44例來自本院的HIV-1感染者的全血，分別制備血漿、全血DBS樣品，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)分別擴(kuò)增血漿和全血DBS樣品HIV-1 RNA并進(jìn)行基因型耐藥分析，將血漿和DBS檢出結(jié)果進(jìn)行對比，比較二者在檢出率、HIV-1病毒載量、亞型、耐藥突變位點(diǎn)及耐藥檢測結(jié)果等方面的差異，以驗(yàn)證全血DBS樣品用于HIV-1亞型分析和耐藥性檢測的可行性，為其在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院收治的44例HIV-1感染者的臨床資料。此前均未接受HAART治療。其中男40例，女4例；年齡19～79歲，中位年齡32歲；基線CD4細(xì)胞中位數(shù)289個(gè)/μL、CD8細(xì)胞中位數(shù)923個(gè)/μL、CD4/CD8比例中位數(shù)0.29。

1.2方法

1.2.1樣品制備 靜脈采集44例HIV-1感染者乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝血10 mL，依照文獻(xiàn)[5]中的方法制作全血DBS樣品，每例患者樣品制作3～5個(gè)血斑，室溫干燥保存。將剩余的EDTA-K2抗凝血以3 500 r/min離心5 min，收集血漿，制備血漿樣品，-20 ℃短期保存或-80 ℃長期保存。

1.2.2HIV-1 RNA提取 血漿樣品RNA提?。喝?00 μL的血漿用核酸提取純化試劑盒(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)于Smart 32核酸提取儀(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)進(jìn)行提取，所得RNA保存于-80 ℃。DBS樣品RNA提?。杭羧BS濾紙片，按照海力特核酸提取試劑盒(廣州海力特生物科技有限公司)的操作說明進(jìn)行RNA提取，將所得的RNA樣品保存于-80 ℃。

1.2.3HIV-1 病毒載量測定 分別吸取提取的血漿或DBS樣品的RNA 20 μL，按照HIV-1核酸測定試劑盒(PCR熒光探針法，中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)操作說明加樣，于ABI Viia7高產(chǎn)率熒光定量PCR儀(Lifetech，美國)上機(jī)測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品病毒載量。

1.2.4RT-PCR反應(yīng) 采用巢式PCR反應(yīng)擴(kuò)增HIV-1 Pol區(qū)基因序列(HXB2,2253～3318 nt)，使用PrimescriptTMone step RT-PCR Ver.2.0試劑盒(TAKARA,日本)對提取的病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增[6-7]。第1輪擴(kuò)增使用外引物：MAW引物序列為5′-TGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3′，RT-21引物序列為5′-CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG-3′。反應(yīng)程序：25 μL體系，50 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。第2輪PCR擴(kuò)增使用內(nèi)引物：PRO-1引物序列為5′-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3′，RT-20引物序列為5′-CTGCCAGTTCTAGCTCTGCTTC-3′。反應(yīng)程序：50 μL體系，95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，31個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。

1.2.5Sanger 測序 將已擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用QIAquick 膠回收試劑盒(QIAGEN,德國)純化后進(jìn)行Sanger測序，委托天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2.6系統(tǒng)進(jìn)化樹分析及亞型鑒定 Sanger測序得到的Pol區(qū)前1 300個(gè)堿基序列，用Sequencher 5.4.5軟件雙人對序列進(jìn)行清理和拼接，混合堿基按照30%比例主峰的次級(jí)峰進(jìn)行判定。采用BioEdit 7.2軟件對拼接好的序列進(jìn)行比對[8]。采用MAGE 6.06軟件建立鄰接法進(jìn)化樹，參考株選擇HIV-1病毒M組亞型株A(A1、A2)、B、C、D、F(F1、F2)、G、H、J、K、CRF01-AE、CRF07-BC、CRF08-BC、CRF55-01B、CRF59-01B、CRF67-01B等，下載自HIV Database數(shù)據(jù)庫(www.hiv.lanl.gov/content/index)。

1.2.7HIV-1基因型耐藥分析 將Fasta序列文件，輸入HIV Database數(shù)據(jù)庫BLAST對亞型進(jìn)行比對，將序列提交Stanford HIV耐藥數(shù)據(jù)庫(https://hivdb.stanford.edu/hivdb/by-sequences/)分析蛋白酶抑制劑(PI)、核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTI)以及非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI)基因型耐藥突變[9]。

2 結(jié) 果

2.1血漿和DBS樣品PCR擴(kuò)增檢出率 44例HIV-1感染患者治療前血漿樣品提取RNA后PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)目的條帶有44個(gè)，陽性檢出率為100.0%(44/44)；在DBS樣品中，1%瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)目的條帶的有30個(gè)，無條帶樣品為14個(gè)，DBS樣品陽性檢出率為68.2%(30/44)。

2.2血漿和DBS樣品病毒載量 24例治療前HIV-1感染患者血漿樣品和DBS樣品熒光定量PCR探針法檢測HIV-1病毒載量。結(jié)果顯示，血漿樣品中病毒載量均達(dá)到1.0×103IU/mL以上，平均病毒載量為5.02×105IU/mL，中位數(shù)為1.76×105IU/mL；DBS樣品中平均病毒載量為1.46×103IU/mL，中位數(shù)為7.95×102IU/mL，DBS樣品病毒載量遠(yuǎn)低于血漿樣品。

2.3系統(tǒng)進(jìn)化分析 44例血漿樣品和30例DBS樣品Pol區(qū)基因序列與參考株在BioEdit 7.2軟件比對后，MEGA 6.06軟件建立鄰接法進(jìn)化樹。通過鄰接法進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，這44例患者所感染HIV-1為CRF07-BC(24/44)、CRF01-AE(16/44)、CRF59-01B(2/44)、B(1/44)、CRF67-01B(1/44)，其中CRF07-BC和CRF01-AE為主要亞型病毒株。同時(shí)，對血漿和DBS基因序列比較發(fā)現(xiàn)，30例擴(kuò)增檢出成功的DBS Pol區(qū)基因序列與血漿樣品Pol區(qū)序列相似值為100%的有26例(26/30)，相似值為99%的有3例(3/30)，相似值為97%的有1例(1/30)，提示血漿和DBS Pol區(qū)基因序列具有高度的一致性。

2.4血漿和DBS樣品基因型耐藥的差異 治療前血漿樣品中有6例出現(xiàn)基因型耐藥，且6例患者對PI均未產(chǎn)生耐藥突變位點(diǎn)。其中1例血漿樣品在D67N(1/44)和K219Q(1/44)位點(diǎn)產(chǎn)生對NRTI耐藥突變，D67N位點(diǎn)對阿巴卡韋(ABC)、去羥肌苷(DDI)、替諾福韋(TDF)存在潛在低水平耐藥；K219Q位點(diǎn)對齊多夫定(AZT)、司他夫定(D4T)存在低水平耐藥。在NNRTI中，V179D(3/44)、V179E(2/44)、G190A(1/44)發(fā)生突變，在V179E/D位點(diǎn)主要對依法韋侖(EFV)、依特韋林(ETR)、奈韋拉平(NVP)及利匹韋林(RPV)存在潛在低水平耐藥；G190A對ETR有潛在低水平耐藥性，對RPV低水平耐藥性，對EFV有中等耐藥性，而對NVP產(chǎn)生高度耐藥性。在成功檢出的30例DBS樣品中，3例DBS樣品出現(xiàn)了耐藥突變，其中1例同樣在D67N(1/44)和K219Q(1/44)位點(diǎn)出現(xiàn)NRTI耐藥突變，這3例DBS樣品分別在V179E(1/44)、V179D(1/44)G190A(1/44)位點(diǎn)出現(xiàn)NNRTI耐藥突變，耐藥分析的結(jié)果與血漿一致。與血漿樣品的基因型耐藥檢測結(jié)果相比，DBS樣品HIV-1亞型、耐藥突變位點(diǎn)和耐藥分析結(jié)果均一致，但是在PI和RTI的其他突變位點(diǎn)中，DBS樣品在位點(diǎn)突變數(shù)量和突變形式均有一定的差異。

3 討 論

隨著ART在全球規(guī)模的推廣，HIV-1感染的發(fā)病率和病死率顯著降低。但是，HIV耐藥性對ART的長期效果構(gòu)成潛在威脅，并且正在成為聯(lián)合國2016年報(bào)告的“到2030年消除HIV作為全球公共衛(wèi)生安全問題”的巨大威脅，監(jiān)測ART耐藥有利于及時(shí)對患者用藥做出調(diào)整[10-11]。目前，利用RT-PCR對HIV-1 Pol區(qū)基因型檢測是對ART耐藥監(jiān)測的主要方法。常規(guī)耐藥檢測樣品使用的一般是HIV患者的血漿，但是血漿在采集、運(yùn)輸及保存方面并不占優(yōu)勢，而DBS樣品由于其良好的穩(wěn)定性、易運(yùn)輸性以及采集方面的優(yōu)勢，成為血漿樣品耐藥檢測潛在的良好替代品。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DBS與血漿樣品在亞型分析結(jié)果以及耐藥結(jié)果上保持一致，雖然在個(gè)別其他突變位點(diǎn)上存在一定差異，但是并不影響耐藥結(jié)果的準(zhǔn)確性。有研究發(fā)現(xiàn)，DBS樣品可用于HIV抗體和抗原檢測、HIV核酸定性和定量檢測、HIV基因型別與耐藥性的篩查鑒定等，與配對血漿樣品具有99%以上的一致性[12-13]。DBS樣品相比于血漿在陽性檢出率及病毒載量方面均有較大的劣勢。

本研究中，DBS樣品陽性檢出率為68.2%，平均病毒載量為1.46×103IU/mL，分布在1.30×102～7.90×103IU/mL；而血漿樣品檢出率達(dá)到100.0%，平均病毒載量5.02×105IU/mL，分布在6.64×103～3.30×106IU/mL，DBS樣品病毒載量要遠(yuǎn)低于血漿。由于在本研究中，只剪取了1個(gè)DBS濾紙片，這可能是DBS樣品檢出率低于血漿的主要原因。結(jié)合上述分析，后續(xù)增加DBS濾紙片的數(shù)量，提取RNA可能會(huì)大大提高DBS樣品檢出率。

亞型分析中，將所有比對完成的序列和參考株序列通過MAGE 6.06軟件建立鄰接法進(jìn)化樹，共鑒定出5種HIV-1病毒株：B型、CRF01-AE、CRF59-01B、CRF67-01B、CRF07-BC，且DBS與血漿樣品基因序列高度一致。同樣耐藥分析結(jié)果顯示，在44例血漿樣品中6例出現(xiàn)耐藥突變，在成功檢出的DBS樣品中有3例出現(xiàn)耐藥突變。與血漿樣品耐藥分析結(jié)果相比，除了少數(shù)其他突變位點(diǎn)存在差異，DBS耐藥結(jié)果與血漿高度一致，通過比對差異位點(diǎn)的堿基發(fā)現(xiàn)，主要是因?yàn)榇嬖诨旌蠅A基導(dǎo)致其他位點(diǎn)的突變存在差異。這為DBS樣品應(yīng)用于HIV患者的耐藥分析及亞型分析提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

目前，DBS樣品檢測已應(yīng)用于耳聾基因檢測[14]、梅毒酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測[15]、新生兒足跟血DBS篩查地中海貧血[16]以及孕婦中期DBS產(chǎn)前檢測[17]等的報(bào)道，DBS在臨床檢測方面的應(yīng)用逐步擴(kuò)大。結(jié)合本研究的結(jié)果，雖然DBS樣品在檢出率上與血漿相比仍有所不足，但是DBS樣品在采集和運(yùn)輸方面更加便利，DBS樣品充分干燥后可按非感染性物質(zhì)運(yùn)送，不需要傳統(tǒng)的血漿或全血樣品冷鏈運(yùn)輸，這極大地節(jié)約了運(yùn)輸成本。對于我國偏遠(yuǎn)地區(qū)，由于技術(shù)和交通方面均較為落后，HIV耐藥監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查不方便開展，DBS樣品此時(shí)就具有巨大的優(yōu)勢。另一方面，DBS樣品亞型分析結(jié)果與耐藥分析結(jié)果的準(zhǔn)確性也為DBS樣品的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。因此，優(yōu)化后的DBS樣品檢測將是未來HIV耐藥監(jiān)測以及流行病學(xué)調(diào)查的一個(gè)創(chuàng)新模式。