生物來源水凝膠在膀胱組織工程中的研究進展

安子彥，肖樹偉，符偉軍，張 旭

1 解放軍醫(yī)學院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心 泌尿外科，北京 100853

因腫瘤、創(chuàng)傷、炎癥和醫(yī)源性損傷而造成的膀胱受損患者需要進行膀胱切除，為了維持患者的儲尿排尿功能，常需要用腸道替代法來重建膀胱，但這種方法存在較多不足，如代謝并發(fā)癥、吻合口感染、尿路感染、結石形成等[1]。因此越來越多的研究者將目光轉向了膀胱組織工程學，嘗試制備出人工膀胱用于修復受損膀胱[2]。膀胱組織工程主要包括種子細胞、膀胱支架和生長因子三大部分。作為核心之一，膀胱支架的理想材料應具備良好的生物相容性、低免疫原性和可降解性，還應有合適的機械性能，并使其能夠起到防感染屏障作用。既往已經(jīng)有許多材料被用于制作膀胱支架，如大網(wǎng)膜、小腸黏膜下層、膀胱脫細胞基質(bladder acellular matrix，BAM)以及一些合成聚合物材料等，但通常會導致移植物攣縮、降解殘余、瘢痕形成、泌尿系炎癥及結石等問題[3]。生物來源水凝膠的成分和結構與天然細胞外基質(extracellular matrix，ECM)相似，是一種三維網(wǎng)狀結構的具有親水性、不溶性的聚合物，可以吸收大量水分或生物流體[4]。與合成聚合物相比，生物來源水凝膠可以保存一些天然分子，如生長因子、多糖和天然蛋白等，能夠促進細胞生長分化和血管生成，具有抗菌作用，有更好的生物相容性、降解性和免疫原性，能為細胞生長提供機械支撐和水合環(huán)境，且來源豐富易獲取、加工制作相對容易，其良好的生物相容性和可降解性適用于制作膀胱支架。這些優(yōu)點引起了研究者的普遍關注。本文將對生物來源水凝膠的種類及其在膀胱組織工程中的研究進展進行綜述。

1 膠原水凝膠

膠原是哺乳動物組織中含量最豐富的蛋白質，占全身蛋白質的20%-30%，其基本結構由3條多肽鏈相互纏繞而成，通過氫鍵和共價鍵彼此連接，結構穩(wěn)定[5]。膠原的抗原性低，可生物降解，但完全以水凝膠的形式存在時力學性能很差。為了改進這一缺點，Engelhardt等[6]嘗試將聚(乳酸-co-з-己酯)網(wǎng)狀物鑲嵌到兩層膠原凝膠之間，然后進行塑性壓縮，構建出一種混合支架，能夠承受膀胱內壓力，細胞在支架上的附著和增殖情況良好，具備膀胱組織再生的潛力。而且這種復合結構還克服了單純膠原凝膠不適用于縫合的缺點，能夠防止支架在體內收縮變形。與單純聚(乳酸-co-з-己酯)網(wǎng)狀物相比，混合支架在體內炎癥反應更弱，不會發(fā)生強烈的細胞浸潤，這可能是因為膠原層將聚合物與宿主細胞在物理上隔絕。因此將合成聚合物與生物水凝膠材料相結合可能是增強混合支架生物相容性的一種實用方法。Vardar等[7]制備了一種可與纖維蛋白共價結合的人胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)，并將其層疊于經(jīng)塑性壓縮的膠原-纖維蛋白-膠原凝膠之間，以纖維蛋白為兩層膠原之間的粘連材料，構建了一種多層復合支架。實驗證明這種方法可以顯著提升支架的力學性能，其抗拉力強度與天然膀胱組織相當，且增加了支架的密封性和可縫合性。此外IGF-1在支架內作用明顯，可以有效誘導平滑肌細胞(smooth muscle cells，SMCs)增殖分化。說明膠原凝膠是一種合適的組織工程材料，為膀胱重建提供一種新的途徑。

2 明膠水凝膠

明膠是膠原的衍生物，將膠原的天然三螺旋結構分解為單鏈分子可獲得。為了將明膠用作生物材料，通常用共價交聯(lián)方法克服其在常溫下的不穩(wěn)定性。近年來有研究者以明膠為原料，通過對甲基丙烯酰基進一步化學改性制得甲基丙烯酰明膠(gelatin methacrylate，GelMA)水凝膠[8]。GelMA保留了明膠的良好降解性和低免疫原性，可促進各種細胞的黏附與增殖，并且具有可調節(jié)的物理化學性質，在組織工程中有著極為廣泛的用途。Xiao等[9]將海藻酸二醛與明膠共價交聯(lián)為水凝膠后包裹脂肪來源干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)，然后與BAM移植物、絲素蛋白網(wǎng)構建了一種“三明治”樣復合支架：BAM作為防水屏障，水凝膠包裹ADSCs，絲網(wǎng)增強機械強度，并建立大鼠膀胱擴大成形術模型進行動物實驗；結果表明該支架力學性能顯著增強，具有良好的細胞相容性和力學性能。該水凝膠系統(tǒng)不僅模擬了ADSCs的細胞外基質生長微環(huán)境，還可以將其輸送到所需的區(qū)域，促進膀胱缺損的形態(tài)恢復和平滑肌、神經(jīng)的再生，加快膀胱功能恢復。被包裹的ADSCs還可以通過SDF-1α/CXCR4途徑發(fā)揮促血管生成作用。此外ADSCs加速了水凝膠的降解，減少了降解殘余和炎癥，但并不能完全消除因炎癥形成的膀胱結石。總體來說，將明膠改性或制成雜化水凝膠后，在膀胱組織工程中能發(fā)揮更重要的作用。

3 纖維蛋白水凝膠

纖維蛋白在傷口自然愈合過程中起著重要的作用，在外科手術中已被用作密封劑和黏合劑，且不會導致毒性降解或炎癥反應。纖維蛋白水凝膠可以通過向含有凝血因子Ⅷ和Ca2+的纖維蛋白原溶液中加入凝血酶制成，其降解速率可用蛋白酶抑制劑控制。纖維蛋白可從患者自身血液中提取，因此不會有異物反應的潛在風險[10]。并且纖維蛋白水凝膠可被用來設計搭載血管內皮生長因子，促進組織的血管化和血液灌注[11]。Jaimes-Parra等[12]曾用膀胱基質細胞和纖維蛋白-瓊脂糖支架構建生物工程膀胱黏膜模型，體外研究結果提示生物工程化的膀胱黏膜模型與天然膀胱黏膜具有相同的結構和相似的功能，但在細胞分化階段效果不甚理想。最新研究發(fā)現(xiàn)通過調節(jié)纖維蛋白水凝膠的硬度可以影響細胞的分化方向[13]。因此未來可嘗試將纖維蛋白水凝膠用于膀胱組織工程并進行動物實驗研究。

4 絲素蛋白水凝膠

絲素蛋白(silk fibroin，SF)是一種來源于昆蟲的天然蛋白質，當前使用最廣泛的絲素蛋白來源于家蠶，絲蛋白和絲膠是其主要成分。SF可以在水或各種溶劑中加工成具有不同化學功能的水凝膠、纖維或海綿[14]。Floren等[15]發(fā)現(xiàn)通過改變SF在水溶液中的濃度，可以獲得不同硬度的SF水凝膠，且主要結構參數(shù)不變；還發(fā)現(xiàn)SF水凝膠與生長因子結合后，在一定培養(yǎng)時間(72 h)內可以增強人骨髓間充質干細胞向成熟平滑肌細胞分化的能力。這一發(fā)現(xiàn)表明通過設計細胞生長的微環(huán)境，即調節(jié)水凝膠性能和生長因子，可以簡化復雜的細胞分化策略。Buitrago等[16]首次報道了由絲素蛋白和膠原組成的雜化水凝膠。這種絲素蛋白-膠原水凝膠克服了單純絲素蛋白(缺乏細胞黏附基序)和單純膠原蛋白(細胞介導收縮)的局限性，加速了細胞的黏附，并改善了抗收縮性以抵抗細胞的牽引力，具有較高的抗變形能力；并且在細胞三維培養(yǎng)中能長期保持人骨髓間充質干細胞的活力和增長。除此之外，Mauney等[17]運用凝膠紡絲技術，將SF溶液制成紡絲凝膠后構建膀胱支架，并在小鼠體內實施膀胱擴大術，結果表明該支架能夠促進尿路上皮細胞(urothelial cells，UCs)和SMCs再生，減少了慢性炎癥反應，未見膀胱結石形成，且尿流率、排尿量和膀胱容量均明顯增加。以上研究表明，SF水凝膠能夠促進種子細胞的分化和增殖，在膀胱組織工程中有良好的應用前景。

5 透明質酸水凝膠

透明質酸(hyaluronic acid，HA)由重復的二糖構成(D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖)，是一種非硫酸化的線性糖胺聚糖，存在于哺乳動物的所有組織中，包括皮膚、臍帶、軟骨、滑液和玻璃體體液。通過化學交聯(lián)、光交聯(lián)或改性，HA可以轉變?yōu)榫哂胁煌飳W特性的水凝膠[18]。Kihak等[19]用光聚合法制備了肝素-透明質酸水凝膠(Hep-HA)，將人ADSCs包裹在其中構建三維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。實驗觀察發(fā)現(xiàn)在三維培養(yǎng)系統(tǒng)中，Hep-HA可以有效促進ADSCs的生長、增殖和遷移，并且ADSCs中分泌有較多的透明質酸酶，能夠加速Hep-HA的降解。Sivaraman等[20]將丙烯酸酯、HA和Ⅰ型膠原交聯(lián)制備了一種復合水凝膠三維網(wǎng)狀支架，用于膀胱SMCs的包埋，發(fā)現(xiàn)HA對復合水凝膠的力學性能有強化作用，對復合支架的彈性模量(剛度)有顯著影響；且HA的降解促進了細胞的擴散和遷移，使SMCs在支架上的分布增加。在種植SMCs并培養(yǎng)兩周后顯示該水凝膠支架的力學性能(峰值應力、峰值拉伸力和彈性模量)顯著提高。因此基于HA的復合水凝膠不僅可以誘導促進細胞的分化與增殖，還能改善支架機械性能，具有很好的實用性。

6 細胞外基質水凝膠

ECM是一種天然衍生材料，包括生長因子、膠原、層黏連蛋白、纖維連接蛋白、糖胺聚糖和蛋白多糖，為維持組織內穩(wěn)態(tài)提供重要的生物因子和物理支撐[21-22]。ECM材料主要來源于豬組織，在溶解后通過調節(jié)溫度或pH可形成水凝膠[23]。ECM水凝膠是一種理想的生物材料，它包含除活細胞之外的所有組織成分，且擁有良好的生物學特性。BAM是來源于ECM的一種材料，適用于修復和重建泌尿系統(tǒng)。但其表面致密平滑，不能很好地促進平滑肌再生和血管形成，可能導致膀胱纖維化并最終影響遠期膀胱功能。因此Jiang等[24]用胃蛋白酶酶解法將BAM制備為膀胱脫細胞基質水凝膠(bladder acellular matrix hydrogel，BAMH)。由于凝膠過程中形成了新的化學鍵，因此BAMH的熱穩(wěn)定性較BAM顯著提高。研究發(fā)現(xiàn)生長因子在BAMH中的保存與釋放良好，且BAMH有助于內皮細胞的黏附與增殖。實驗結果證明來源于膀胱的BAMH具有良好的生物相容性，在泌尿外科領域具有廣闊的應用前景，如尿道重建、膀胱再生等。

7 水凝膠與3D生物打印

與傳統(tǒng)組織工程學相比，3D生物打印可以跳過細胞種植過程，通過計算機輔助建模，3D打印機將細胞、生物材料與生物活性因子相混合，分層打印為仿生組織，實現(xiàn)了對細胞分布和空間結構的精確控制[25]，且這種工業(yè)化制作模式還可以避免因制作批次不同而導致的成品性能差異。事實上，只有很少的天然或合成聚合物可以在溫和的溫度或細胞耐受的條件下用作3D生物打印的生物墨水。而膠原[26]、明膠[27]、絲素蛋白[28]、ECM[29]等因具有良好的可打印性、可降解性和穩(wěn)定性被視為3D生物打印的首選材料。現(xiàn)在這種基于水凝膠的生物墨水已被廣泛應用于多種組織工程中，如皮膚[30]、軟骨[31]和心臟[32]等。在泌尿系統(tǒng)中，既往有研究者通過3D打印機將聚己內酯/聚丙交酯-己內酯混合物與負載有SMCs和UCs的纖維蛋白水凝膠同時打印，制作出的柱狀尿道支架在結構、力學性能和細胞成分特征上與天然兔尿道非常接近[33]。雖然目前還無研究者進行3D打印膀胱的實驗，但未來必定可以制備出符合預期機械性能和生化特性、具備正常功能的3D打印膀胱支架。

8 結語

現(xiàn)階段多數(shù)膀胱組織工程的探索仍處在實驗階段。在基于水凝膠的膀胱移植物能夠大規(guī)模應用于臨床之前，仍有幾個問題需要解決：1)當前多數(shù)工程化膀胱組織中缺乏復雜的微血管系統(tǒng)，如何增強其構建血管網(wǎng)絡的能力；2)探明水凝膠對細胞誘導分化作用的具體機制，以及對膀胱組織再生的影響；3)在構建多層復合支架時，明確水凝膠與其他材料間的相互作用，使支架性能達到最佳；4)探索制備新型水凝膠生物墨水及其在3D打印設備中的應用參數(shù)，以期實現(xiàn)3D生物打印技術對傳統(tǒng)膀胱組織工程的變革。盡管存在諸多挑戰(zhàn)，但未來水凝膠的不斷更新和優(yōu)化必將彌補這些不足，并為膀胱組織工程帶來革命性的改變。