引起某蛋雞場產蛋率下降的病原分離鑒定

張 飄，李 濤，楊 霞，胡安東，潘吉脈，劉妍罕，曾茂芹，文 明,4*

(1. 貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 動物疫病研究所，貴州 貴陽 550025；3. 貴州省動物疫病預防控制中心，貴陽 550025；4.貴州省動物疫病與獸醫公共衛生重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)屬芽孢桿菌科，蠟樣芽孢桿菌屬，為革蘭氏陽性菌，外界環境惡劣時會產生芽孢，兼性厭氧生存。近年來，蠟樣芽孢桿菌大部分菌株作為有益微生物廣泛地被添加到飼料和食品中，取得了可喜的效果，添加在飼料中可提高仔豬的生產性能[1]，甚至其還可以發酵降解羽毛[2]。但不可忽視的是該菌也是一種條件致病菌，在一定條件下會給機體帶來嚴重的威脅[3]。黃晶菁等[4]報道，該菌曾被多次報道引起食物中毒，在養殖過程中引起動物機體發病甚至死亡，且新生兒上呼吸道感染和臍帶炎也與蠟樣芽孢桿菌相關。2019年11月貴州省某蛋雞養殖場高峰產蛋蛋雞產蛋率突然下降10%～20%不等，蛋殼變薄，雞只出現零星死亡，送本實驗室進行診斷，查找病因。

1 材料與方法

1.1 材料

發病產蛋活雞(8只)，由貴州省某養殖場送檢；普通平板、鮮血平板、麥康凱平板、LB培養基、生化鑒定管、抗菌藥物藥敏紙片均購自杭州微生物試劑有限公司；細菌DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒和DL2000 DNA MarKer均購自天根生化科技(北京)有限公司；25只15日齡雛雞由貴州大學動物疫病研究所饋贈。

1.2 方法

1.2.1 流行病學調查 按照動物疫病調查常規方法進行雞場蛋雞產蛋下降的流行病學調查。

1.2.2 剖解病變觀察 通過剖解病變觀察對送檢活雞進行無菌病理剖解及大體病變觀察。

1.2.3 病毒PCR檢測 病毒PCR鑒定采集送檢的8只發病蛋雞的肺臟、肝臟和脾臟樣本，單只組織樣本混合,用RNA提取試劑盒提取總RNA，反轉錄為cDNA，PCR檢測雞傳染性支氣管炎病毒(IBV，登錄號為KU900742)、禽流感病毒(AIV)[5]、新城疫(NDV，登錄號為AY325796)、減蛋綜合征病毒(EDSV)[6]、禽白血病病毒 (ALV)[7]、支原體(MS)[8]和雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV，登錄號為EF552578)。PCR引物參照相關文獻或標準株設計，引物及退火溫度見表1，引物由上海生工合成，PCR反應產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.4 細菌分離鑒定 無菌采集送檢病雞的肝臟、卵巢和法氏囊積液樣本, 接種環劃線接種于普通平板、鮮血平板、麥康凱平板,厭/需氧條件下均放置于37 ℃恒溫箱培養24 h后挑取形態一致的優勢菌落，平板劃線得到純培養菌株，再轉接到LB液體培養基中震蕩培養24 h后4 ℃備用。將分離純化的菌落進行純培養、革蘭氏染色、鏡檢、觀察菌體特征、接種于細菌生化鑒定管中，37 ℃恒溫培養24～48 h后觀察結果并參照《伯杰細菌鑒定手冊》[9]進行判定；將分離純化菌液在超凈工作臺中均勻涂抹于LB平板，用20種藥敏片進行藥敏試驗，37 ℃恒溫箱培養24 h，記錄抑菌圈直徑并根據抑菌圈直徑判定分離菌的藥物敏感性；將純化后的細菌利用DNA提取試劑盒提取總DNA,并用16S rDNA通用引物進行PCR擴增，PCR反應產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，擴增有目的條帶送深圳華大基因股份有限公司進行測序后，利用MEGA7.0和DNA star軟件構建遺傳進化樹和同源性分析。

表1 基因引物信息Table 1 Gene primer information

1.2.5 半數致死量及動物回歸試驗 將分離的優勢菌通過麥氏比濁法將菌液濃度調整至1.0×109cfu/mL，并將配好的1.0×109cfu/mL菌液按照10倍系列稀釋至1.0×105cfu/mL，4 ℃備用。25只15日齡雛雞分為5組，每組5只，每組每只均腹腔注射相同濃度蠟樣芽孢桿菌1 mL，共計5個梯度濃度，觀察雛雞活動狀態及死亡情況，直到不再出現雛雞死亡，對死亡雛雞組織進行平板劃線，做生化試驗，確定死亡原因，并觀察發病雛雞與送檢病雞是否具有相同癥狀。

2 結果與分析

2.1 流行病學調查

貴州省某養殖場于2019年11月份開始，其產蛋高峰期蛋雞突然產蛋率下降20%～10%不等，雞只出現零星死亡，該蛋雞廠蛋雞發病前飼養環境、飼料及飲水未做改變，產蛋下降蛋雞外觀無異常。發病前一直有在飼料中添加中草藥混合飼喂，發病后使用中草藥治療效果不佳，改用抗生素治療，在使用部分抗生素后蛋雞產蛋率恢復、不出現死亡蛋雞，但停用后產蛋率又下降、雞只出現零星死亡。

2.2 剖解病變觀察

對送檢發病活雞進行剖解病變觀察, 發現其主要病理變化為肝臟腫大質地變脆并伴有出血點，脾臟腫大，法氏囊透明化且內充滿乳白色液體，盲腸端充氣，其他臟器和組織無明顯病變(圖1)。

2.3 病毒PCR檢測結果

通過普通PCR對送檢的病雞檢測，未能擴增出雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)、新城疫(NDV)、減蛋綜合征病毒(EDSV)、禽白血病病毒 (ALV)、支原體(MS)和雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)7種病毒特異性核酸片段，說明未感染這7種病毒(圖2)。

圖1 剖解病理變化A. 脾臟腫大；B. 肝臟腫大質地變脆并伴有出血點；C. 法氏囊透明化且內充滿乳白色液體；D. 盲腸鼓氣Fig.1 Pathological changes

2.4 細菌分離鑒定結果

2.4.1 細菌分離 僅在肝臟鮮血平板生長出1種菌落并將其命名為GZ201911，其他組織器官未見細菌生長。形態整體呈蠟滴狀，有溶血環，為不透明的白色菌落(圖3)。挑取單個菌落進行革蘭氏染色，鏡檢后觀察到單個或鏈狀排列的革蘭氏陽性桿菌(圖4)。

圖2 病毒基因PCR擴增結果A. IBV;B. AIV;C. NDV;D. EDSV;E. ALV(A);F. ALV(B);G. ALV(J);H. MS;I. ILTVM. DL2000 DNA Marker；1～8.樣品；+. 陽性對照；-. 陰性對照Fig.2 PCR results of virus genesM. DL2000 DNA Marker;1～8. The samples;+. Positive control;-. Negative control

2.4.2 細菌生化試驗結果 純化菌液接種于生化鑒定管中，結果發現該分離菌不具有運動性, 能利用葡萄糖、不能利用苯丙氨酸、蛋白胨水(靛基質)、木糖和枸櫞酸鹽等；不產生硫化氫, MR.VP反應陽性; 賴氨酸和鳥氨酸陽性, 符合蠟樣芽孢桿菌的生理生化特征(表2)。

2.4.3 藥敏試驗結果 對藥敏試驗結果進行記錄并分析(表3)，結果顯示：該菌對氟苯尼考、環丙沙星、四環素、氧氟沙星、多西環素和克林霉素6種藥物敏感，對復方新諾明、頭孢他啶、哌拉西林、多粘菌素B、頭孢氨芐等藥物中度敏感,對青霉素、新霉素、克林霉素等藥物耐藥。

2.5 16S rDNA基因測序同源性分析

采用16S rDNA通用引物對分離菌株GZ201911進行PCR擴增，陽性產物經測序后得到大小為1 485 bp的基因序列(圖5)。利用MEGA 7.0和DNAstar軟件對分離菌株16S rDNA測序結果，建立系統進化樹并做同源性分析發現：其與四川YB18株(KJ720022)親源關系最近，同源性為99.8%；與巴西FT9株(CP008712)親源關系最遠，同源性為98.8%；與摩洛哥CCMMB613株JN208091、山西HDK07株KX905299、四川XH18株KU986648、四川YB18株KJ720022、湖北TD8株GQ381283、美國2000031486株AY138272、美國ATCC 14579株NR074540、朝鮮FORC60株CP020383、湖南HN1203株JX294967、巴西FT9株CP008712的同源性介于二者之間(圖6)。

圖3 分離菌株及溶血環Fig.3 Hemolysis of the isolated strain

圖4 革蘭氏染色菌落形態(1 000×)Fig.4 Colony morphoiogy of gram staining(1 000×)

表2 分離菌生化反應結果Table 2 Biochemical test results of the isolated strain

表3 分離菌株藥敏試驗結果Table 3 Susceptibility test results of the isolate

2.6 半數致死量及動物回歸

根據改良寇氏法[10]計算LD50(lg(LD50)=Xm-d(∑Pi-0.5))：其中:Xm為最大劑量對數；d為相鄰兩組劑量對數之差數；Pi為死亡率,i為組號，經計算為5.01×107cfu/mL(表4)。對死亡雛雞內臟組織進行細菌分離培養, 生化結果與原分離菌相同, 說明雛雞死亡是由蠟樣芽孢桿菌引起，雛雞剖解癥狀與送檢蛋雞剖解癥狀相同，但發現法氏囊透明充滿積液的癥狀較送檢蛋雞癥狀輕。

3 討 論

引起蛋雞產蛋率下降或者死亡的病因隨著近年來養殖密度的不斷加大也越來越多，其中包括新城疫病毒[11]、雞傳染性支氣管炎病毒[12]、禽白血病病毒、雞產蛋下降綜合征病毒[13]等，但大多數都伴隨相應的癥狀或者組織病變。而本次貴州省某蛋雞養殖場蛋雞突然發病，其主要病理變化為肝臟腫大，質地變脆，并伴有出血點；脾臟腫大，法氏囊透明化且內充滿乳白色液體；盲腸端充氣，癥狀不典型；其他臟器和組織無明顯病變。經設計特異性引物檢測常見引起產蛋率下降的相關病毒后未見PCR擴增出相應條帶，通過細菌分離鑒定后分離出一株優勢菌GZ201911，經16S rDNA PCR擴增后測序比對后為蠟樣芽孢桿菌，該菌同源性分析發現其與四川株(KJ720022)親源關系最近同源性為99.8%，與巴西株(CP008712)親源關系最遠同源性為98.8%。隨后計算該菌半數致死量發現其對15日齡雛雞半數致死量為5.01×107cfu/mL，發病雛雞主要臨床癥狀與送檢蛋雞相同，但發現雛雞法氏囊透明充滿積液的現象較輕，但具體引起蛋雞法氏囊透明化且有積液的原因及相關機制還不清楚。藥敏試驗結果顯示該菌對對氟苯尼考、環丙沙星、四環素、等藥物敏感，而對復方新諾明、頭孢他啶、哌拉西林、多粘菌素B等藥物嚴重耐藥，這為該蛋雞養殖廠提供了用藥的依據。

圖5 16S rDNA PCR擴增凝膠電泳圖M. DL200DNA Marker;1～2.16S rDNA；-. 陰性對照Fig.5 Gel electrophoresis of 16S rDNA PCR amplificationM. DL200DNA Marker;1～2. 16S rDNA；-. Negative control

圖6 分離株與參考株16S rDNA基因序列系統進化樹Fig.6 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene ofthe isolate and reference strains sequences

表4 人工感染雛雞LD50Table 4 Artificially infected chick LD50

蠟樣芽孢桿菌廣泛分布于土壤、水、空氣和飼料環境中[14]，人感染該菌后往往出現各種炎癥，如眼球炎肺炎、心內膜炎等[15]。而動物機體感染后則表現出不同癥狀，如黃顙魚蠟樣芽孢桿菌引起的肝臟有點狀或塊狀出血,膽腫大呈紫黑色等癥狀[16]；對羅非魚則主要引起肝淡黃色, 腎充血發黑, 脾鮮紅等癥狀[17]；對刺參則在體表出現潰爛藍白斑及大面積潰爛[18]；對豬則主要集中在肺臟和心臟等器官出現白色點狀壞死灶等癥狀[19]。在這里可以看出，該菌對不同動物機體致病后引起的相關癥狀存在較大差異性，但到目前為止均未見到有關于雞感染源蠟樣芽孢桿菌的相關報道，及由該菌引起雞發病后的主要臨床癥狀。雞在感染蠟樣芽孢桿菌后的主要臨床癥狀集中在脾臟、肝臟及法氏囊3個器官，引起器官發生出血腫脹，積液增多，本次分離的蠟樣芽孢桿菌對雛雞的半數致死量為5.01×107cfu/mL，說明該菌的致病性不太強，所以引起的臨床癥狀主要以產蛋量減少，蛋雞零星死亡，若感染強毒株可能癥狀更加明顯。這些結果提示，在使用蠟樣芽孢桿菌在作為益生菌使用時，應該更加要注重其安全性能的檢測。

4 結 論

本實驗室從發病蛋雞體內首次分離到一株雞源致病性的蠟樣芽孢桿菌，半數致死量為5.01×107cfu/mL，患病雞主要病理變化為肝臟腫大、質地變脆并伴有出血點，脾臟腫大，法氏囊透明化且內充滿乳白色液體，盲腸端充氣等，為蠟樣芽孢桿菌的研究提供新的理論依據。