圍產期奶山羊注射5-HTP后血液ceRNA網絡構建分析

胡凱召,趙海瑛,陳順新,杜 瑋,高慧杰,鄭惠玲

(西北農林科技大學 動物科技學院,陜西 楊凌 712100)

奶山羊在產羔前后兩周內的奶山羊由于產道收縮和形成初乳，會消耗掉血液中大量的鈣離子，造成血液中的鈣離子濃度迅速降低，極易引發低血鈣癥[1]。并伴隨著產后癱瘓、乳腺炎、酮病、胎衣不下等疾病[2]，對奶山羊產業造成巨大的經濟損失。在外周組織中，L-色氨酸在色氨酸羥化酶(Tryptophan Hydroxylase 1，TPH1)的作用下生成5-HTP，5-HTP在芳香族氨基酸脫羧酶的作用下可以生成5-HT[3-4]。5-HT可以誘導甲狀旁腺激素相關肽(Parathyroid Hormone-related Peptide，PTHrP)的表達，增強破骨細胞的活性[5]，溶解骨骼中的鈣釋放到血液中[6-7]。此外5-HT還可以誘導山羊乳腺上皮細胞中與鈣代謝有關基因的表達，從而調控山羊乳腺上皮細胞向乳汁中釋放鈣離子[8-9]。

人類基因組中只有2%的基因轉錄的轉錄本可以編碼蛋白質,其余98%的基因轉錄的轉錄本都沒有編碼蛋白質的能力[10]，但近些年研究發現，這些非編碼轉錄本可以影響基因的轉錄翻譯過程，調控編碼蛋白質基因的表達，對生物體的生理活動和代謝過程有著重要的調控作用。2011年Salmena等提出了ceRNA假說，該假說認為在 ceRNA 網 絡 中 ，microRNA為核心元素，mRNA、LncRNA、CircRNA和假基因等作為ceRNA，通過競爭一個或多個microRNA應答元件(microRNA Response Element,MRE)來調節其mRNA的表達，進而行使調節功能[11]。進而調控組織或細胞許多生理活動，包括細胞增殖凋亡、細胞遷移侵襲、脂代謝、糖代謝等[12-13]。

Lin等[14]在人臍靜脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)構建的粥樣硬化模型中發現，LncRNA MKI67IP3可吸附Let-7e,進而調控核轉錄因子-KB(Nuclear Transcription Factor-KB,NF-KB)的表達，并在人動脈粥樣硬化斑塊組織中得到了驗證。 第10染色體缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物基因( Gene Of Phosphate And Tension Homology Deleted On Chromsome Ten ，PTEN)PTEN 是重要的抑癌基因，在黑色素瘤、前列腺癌和膠質母細胞瘤中都已經發現了 PTEN的ceRNA[15-16]。

本試驗通過向圍產期的奶山羊注射5-HTP，提高奶山羊體內5-HT的濃度，在分娩當天采集血液后進行全轉錄組測序，鑒定出差異表達的基因并作富集分析，篩選鑒定出差異表達的LncRNA、microRNA、CircRNA。構建ceRNA 調控網絡，并對網絡中的基因作功進行功能注釋與富集分析。最后篩選出與鈣離子代謝相關的LncRNA/CircRNA-microRNA-mRNA調控網絡，為5-HT調控山羊鈣代謝提供了一種全新的分子機制。

1 材料方法

1.1 試驗樣本采集

從陜西省周至縣宏興奶山羊養殖基地選取6只體況良好、胎次相近，處于妊娠后期的奶山羊，分為2組，每組3只，預產期前7 d開始試驗組靜脈注射濃度為0.8 mg/kg的5-HTP，另一組為對照組，注射等量生理鹽水。分娩當天采集血液，使用Trizol試劑盒提取RNA。

1.2 構建文庫與上機測序

1.2.1 small RNA文庫的構建 RNA樣品檢測合格后按照small RNA文庫構建試劑盒構建文庫，將RNA隨機打斷成片段，分別在RNA兩端連接測序接頭，通過逆轉錄合成cDNA。采用凝膠分離技術篩選目標片段，得到small RNA文庫。

1.2.2 LncRNA文庫的構建 按照LncRNA文庫構建試劑盒構建文庫，加入Fragmentation Buffer將mRNA隨機打斷成片段，加入隨機引物和逆轉錄酶合成第一條cDNA鏈，然后合成第二條鏈。 用AMPure XP珠純化cDNA，之后加上測序接頭。通過PCR富集獲得cDNA文庫。

1.2.3 上機測序 測序由北京百邁克生物科技有限公司完成，采用Illumina HiSeq平臺將構建好的Small RNA、LncRNA文庫進行上機測序。

1.3 差異表達轉錄本的鑒定

1.3.1 差異表達基因的篩選與分析 采用Trommatic對原始測序數據進行過濾，用HISAT2軟件將LncRNA文庫的高質量測序數據與山羊參考基因組進行比對，使用StringTie對轉錄本進行組裝，用FPKM值計算基因的表達量。用EBSeq軟件以log2Fold Change>1，FDR<0.05作為篩選的閾值篩選差異表達的基因。用Metascape(www.metascape.org)對差異表達基因進行富集分析。

1.3.2 差異表達LncRNA的篩選 根據與參考基因組比對的結果，用StringTie軟件組裝轉錄本。采用CPC、CNCI、CPTA和Pfam結構域分析估計候選LncRNA的編碼潛力。取4種分析方法不編碼蛋白質的轉錄本的交集為鑒定出的LncRNA。用StringTie軟件通過FPKM值計算 LncRNA的表達量，EBSeq軟件以log2Fold Change>1，FDR<0.05作為閾值篩選差異表達的LncRNA。

1.3.3 差異表達CircRNA的篩選 根據與參考基因組比較的結果，通過CIRI、find-Circ預測并鑒定CircRNA，用TPM值計算CircRNA的表達量，并用EBSeq軟件以Log2Fold Change> 1，FDR <0.05用作篩選的閾值來篩選差異表達CircRNA。

1.3.4 差異表達microRNA的篩選 對于Small RNA的文庫，用Bowtie軟件將測序數據與非編碼RNA 數據庫進行比對，過濾掉非編碼RNA和重復序列，獲得包含microRNA的注釋序列。利用Bowtie軟件將注釋序列與參考基因組進行序列比對，獲取在參考基因組上的注釋信息。將比對到參考基因組的序列與miRBase數據庫中的成熟microRNA序列進行比對，序列相同的為已知microRNA。對于比對結果不相同的序列，用miRDeep2軟件進行新microRNA的預測。同樣用TPM值計算microRNA的表達量，用EBSeq以 log2fold Change>1， FDR<0.05作為閾值篩選差異表達的microRNA。

1.4 ceRNA網絡的構建與分析

篩選差異表達的mRNA，microRNA，LncRNA，CircRNA和它們的序列，使用這些轉錄本構建LncRNA/CircRNA-microRNA-mRNA調控網絡。使用RNAhybrid和RNA 22設置閾值來預測LncRNA、CircRNA與microRNA的結合情況。滿足這兩個軟件閾值的LncRNA-microRNA和CircRNA-mivroRNA調控關系被保留。對于microRNA-mRNA相互作用關系，使用miRanda設置閾值來預測它們之間的結合情況，滿足閾值的調控關系保留下來。選取LncRNA、/CircRNA與mRNA表達趨勢相同并與microRNA表達趨勢相反的調控關系作為最終的調控網絡。最后使用cytoscape3.6.1構建ceRNA網絡，對于ceRNA網絡中的基因使用Metascape進行富集分析。

2 結果與分析

2.1 差異表達轉錄本的篩選與鑒定

EBSeq軟件設置閾值log2fold Change>1、FDR<0.05來篩選差異表達的mRNA、microRNA、LncRNA和CircRNA，共獲得999個差異表達的mRNA，其中586個上調，413個下調。 篩選出667個差異表達的LncRNA，其中371個上調，296個被下調。 在87個差異表達的microRNA中，有46個上調， 41個下調。 最后，篩選出95個差異表達的CircRNA。 其中，有66個上調，有29個下調。

2.2 差異表達基因的富集分析

如圖1所示，山羊注射5-HTP后主要影響免疫反應過程、無機離子穩態和脂代謝。通過調控對有毒物質的反應、白細胞遷移來影響免疫反應過程。山羊注射5-HTP后會影響無機離子的穩態，主要是體內鈣離子的穩態。

圖1 差異表達基因富集分析Fig. 1 Enrichment analysis of differentially expressed genes

2.3 ceRNA網絡的構建與分析

根據ceRNA的作用機制和RNAhybrid、RNA22和miRanda軟件，構建了ceRNA調控網絡(圖2)。對于CeRNA網絡中的這些mRNA，采用Metascape進行富集分析。如圖3所示，通過LncRNA/CircRNA-microRNA-mRNA調控網絡，Ln-cRNA與CircRNA主要影響小分子的轉運、無機離子(鈣離子)穩態、白細胞介素-8的產生調節和水解酶的活性調節。富集分析結果發現，TLR9、JPH1和GJC2與鈣代謝有關。TLR9可負調節鈣轉運ATP酶的活性。JPH1參與鈣釋放通道活性的調節、鈣離子釋放到胞質溶膠中，GJC2與鈣離子跨膜轉運正調節有關。LncRNAMSTRG.1354.2可以與TLR9競爭性的結合microRNA NC_0308251_46027，從而調節TLR9的表達。TLR9可以影響鈣轉運ATP酶的活性，基于這一作用機制，LncRNA可以參與調控鈣代謝，其他的調控關系也是類似的。

3 討 論

Laporta等[17]使用野生型小鼠、TPH1基因敲除小鼠和TPH1基因敲除后注射5-HTP的乳腺進行轉錄組測序，與TPH1基因敲除的小鼠相比，野生型小鼠增加了5-HT的含量，注射5-HTP后同樣增加小鼠體內5-HT的濃度。通過轉錄組測序分析發現，野生型相對于其它兩組鑒定出62個共同差異表達的基因，進行富集分析結果表明，增加小鼠體內5-HT的濃度后，主要影響鈣穩態、脂質代謝和細胞周期、免疫反應等過程。這與本試驗差異表達基因的富集分析結果基本上是一致的，證實了采用轉錄組測序分析的方法來探究5-HT的生物學功能是可靠的。除此之外，還表明盡管小鼠和山羊是兩個不同的物種，但是在兩個物種之間一些基因是保守的，并且它們的表達都受5-HT濃度的影響。

Weaver等[18]研究發現通過注射或飼喂5-HT的前體物質可增加奶牛體內5-HT的濃度，5-HT的濃度與奶牛泌乳第一天血清中鈣的濃度呈正相關。Zang等[9]在山羊乳腺上皮細胞中用干擾TPH1和添加5-HTP來減少或增加5-HT的濃度，發現5-HT可以促進PTHrP的表達，并以劑量依賴性的方式促進鈣敏感受體(Calcium Sensing Re-ceptor,CASR)的表達，降低鈣轉運質膜ATP酶1(ATPase Plasma Membrane Ca2+Transporting 1，ATP2B1)的表達。這些研究都發現5-HT可以顯著的影響血清中的鈣離子濃度，參與鈣代謝，并且影響與鈣代謝相關基因的表達。這進一步印證了注射5-HTP后轉錄組測序分析的結果。

Watanabe等[19]的綜述中指出腸道的腸嗜鉻細胞在餐后產生5-HT。 在小鼠中，它通過對幾種5-HT受體的作用，誘導脂質濃度降低。此外5-HT通過5-HT受體2A和2C加速脂肪細胞的分化。進而調控脂質代謝。5-HT可以調控許多免疫細胞的儲存、反應和轉運。包括T細胞、巨噬細胞、肥大細胞、樹突狀細胞和血小板，尤其是T細胞[20]。圍產期的奶山羊注射5-HTP后還影響脂代謝和免疫反應過程，這與本研究富集分析的結果是一致的，印證轉錄組測序分析的結果，5-HT確實可以調控脂代謝和免疫反應。5-HT可以通過與其受體作用，激活或抑制細胞內的信號通路，從而調控脂代謝和免疫反應過程[21]。

A

B

Wang等[22]用GEO數據庫中動脈粥樣硬化模型的巨噬細胞和正常的巨噬細胞的全轉錄組測序數據，鑒定出差異表達的LncRNA、CircRNA、microRNA、mRNA，并且構建ceRNA調控網絡。結果發現CircRNA hsa_circ_0028198、hsa_circ_0092317和LncRNAXIST可與天冬氨酸β-羥化酶 (Aspartate Beta-Hydroxylase，ASPH)競爭性地結合miR-543，APSH通過與鈣電壓門控通道輔助亞基α2δ4 (Calcium Voltage-gated Channel Auxiliary Subunit alpha2 delta 4，CACNA2D4)參與鈣代謝。

圖3 ceRNA網絡中的基因富集分析Fig3. Enrichment analysis of the genes in the ceRNA network

CircRNA和LncRNA的最重要機制之一是通過吸附microRNA來阻止microRNA對靶基因的抑制。特定基因的表達受LncRNA / CircRNA-microRNA-mRNA調控網絡的調控，進而影響生物學過程[23-25]。然而，在本研究構建ceRNA網絡中，CircRNA不能調控與鈣代謝有關的基因。2 個LncRNA通過與microRNA競爭性地結合鈣代謝相關的基因來調控鈣代謝。LncRNA與CircRNA通過ceRNA調控網絡行使調控基因表達的作用，進而調控鈣代謝等過程，闡述了一種調控基因表達的新機制。這些分子機制有待進一步細胞分子試驗驗證。

4 結 論

對注射和不注射5-HTP的圍產期奶山羊的血液進行轉錄組測序分析，發現其差異表達基因主要參與鈣代謝、脂質代謝、免疫反應和細胞凋亡等過程。構建ceRNA調控網絡并進行富集分析，發現TLR9、GJC2和JPH1 3個與鈣代謝相關的基因，LncRNA MSTRG.1354.2可與TLR9競爭性地結合 microRNA NC.030825.1_6027,進而調控TLR9的表達，MSTRG.56601.1和MSTRG.101405.3都可以與GJC2、JPH1競爭性地結合NC.030814.1_19917，進而調控GJC2和JPH1的表達。本研究為圍產期山羊鈣代謝調控提供了一種全新的分子機制，為尋找新的防治圍產期奶山羊低血鈣癥的有效方法提供了新思路。