HPLC 法測定曲安奈德益康唑乳膏中的有關物質

郭盛合

華潤三九（南昌）藥業有限公司，江西 南昌 330012

曲安奈德益康唑乳膏，每克分別含曲安奈德1.0 mg 和硝酸益康唑10 mg，曲安奈德為腎上腺皮質激素類藥，具有抗炎抗過敏作用，硝酸益康唑為咪唑類抗真菌藥，兩者聯合用于治療伴有真菌感染或有真菌感染傾向的皮炎、濕疹；由皮膚癬菌、酵母菌、霉菌所致的炎癥性皮膚真菌病；由真菌、細菌所致的皮膚混合感染等。目前國外藥典均未收載曲安奈德益康唑乳膏，《中國藥典》二部（2015 年版）［1］已收載但無有關物質檢查項。因此，筆者參考各國藥典原料藥質量標準和相關文獻［2-12］，建立了高效液相色譜法（HPLC）梯度洗脫測定曲安奈德益康唑乳膏中有關物質的方法，以便更好地控制產品的質量。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695 高效液相色譜儀、梅特勒XS205電子分析天平、S220B 酸度計。

1.2 藥品與試劑

曲安奈德益康唑乳膏［華潤三九（南昌）藥業有限公司，國藥準字 H20074155，規格：1 g ∶曲安奈德1 mg ∶硝酸益康唑10 mg，批號：161201、161202、161203］；曲安奈德雜質A（即曲安西龍，編號E-Y0001459）、曲安奈德（編號100055）、硝酸益康唑（編號100214）、苯甲醇（編號100419）均為中檢院對照品，曲安奈德雜質B（編號T-T-5318）、曲安奈德雜質C（編號L-MM0198.05）、硝酸益康唑雜質A（編號T-I-292）、硝酸益康唑雜質B（編號T-E-543）、硝酸益康唑雜質C（編號T-E-544）均為TLC 標準品。

甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Kromasil 100-5 C18，4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫為45 ℃；以0.077%醋酸銨緩沖液（用磷酸調節pH 值至3.0）-甲醇（80∶20）為流動相A；甲醇-乙腈（40∶60）為流動相B；流速為1.0 mL/min；按下表進行梯度洗脫；檢測波長為240 nm 和225 nm。

表1 HPLC梯度洗脫程序

2.2 系統適用性

另取本品于105 ℃干燥箱中放置2 h，取出后照供試品溶液制備法操作，作為系統適用性溶液。精密量取系統適用性溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，在240 nm 下曲安奈德峰保留時間約為15～17 min，在相對曲安奈德峰tR 約0.45 處應有雜質峰，該雜質峰與苯甲酸峰（相對曲安奈德峰tR約0.5）之間的分離度應不低于1.5。

2.3 溶液的制備

取本品，精密稱定，置100 mL 具塞錐形瓶中，加入甲醇20 mL，60 ℃水浴加熱并振搖使其溶解，冰浴30 min，趁冷濾過，取續濾液作為供試品溶液。精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。

2.4 測定法

精密量取供試品溶液、對照溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

結果判定：240 nm 下，供試品溶液色譜圖中在相對曲安奈德峰保留時間約0.45 和0.88～1.16 間如有雜質峰，除曲安奈德峰外，單個雜質峰面積不得大于對照溶液曲安奈德峰面積的0.5 倍（0.5%），各雜質峰面積的和不得大于對照溶液曲安奈德峰面積的2.0 倍（2.0%）；225 nm 下，供試品溶液色譜圖中相對曲安奈德峰保留時間0.25～2.5 之間如有雜質峰，除溶劑梯度峰、苯甲酸峰（相對曲安奈德峰保留時間約0.5）、曲安奈德峰（15～17 min）、益康唑峰、二丁基羥基甲苯峰（相對曲安奈德峰保留時間約2.4）外，單個雜質峰面積不得大于對照溶液益康唑峰面積的0.2 倍（0.2%），各雜質峰面積的和不得大于對照溶液益康唑峰面積的1.0 倍（1.0%）。

2.5 輔料干擾及雜質定位分離試驗

取主藥雙陰性樣品、曲安奈德單方制劑樣品、硝酸益康唑單方制劑樣品、自制樣品照2.3 供試品溶液的制備方法制成供試品溶液；另取曲安奈德及其已知雜質對照品、硝酸益康唑及其已知雜質對照品加甲醇溶解并稀釋制成混合對照品溶液；另取自制樣品供試品溶液加入混合雜質對照品溶液，制成加雜質的供試品溶液。精密吸取上述溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算各峰分離度。

2.5.1 輔料干擾與雜質分離 供試品溶液和加雜質的供試品溶液有關物質色譜圖見圖1。

圖1 供試品和加雜質供試品的有關物質色譜圖

加雜質的供試品溶液在240 nm 下，陰性樣品、硝酸益康唑及其雜質在曲安奈德主峰、曲安奈德雜質峰、硝酸益康唑單方制劑出峰位置處無色譜峰干擾，表明陰性樣品、硝酸益康唑及其雜質色譜峰對曲安奈德及其雜質檢測無干擾；曲安奈德及其雜質與相鄰色譜峰分離度符合要求，表明240 nm 下曲安奈德及其雜質分離度良好，見表1。

加雜質的供試品溶液在225 nm 下，陰性樣品、曲安奈德及其雜質（RRT 在0.45～0.70，0.90～1.18）在硝酸益康唑主峰、硝酸益康唑雜質對照品、硝酸益康唑單方制劑出峰位置處無色譜峰，表明對硝酸益康唑及其雜質檢測無干擾；硝酸益康唑及其雜質與相鄰色譜峰分離度大部分均符合要求。其中，僅在RRT 1.32 處雜質峰和益康唑峰的分離度為0.34，主要是硝酸益康唑濃度過載導致，但該雜質為非降解雜質，雜質量僅為0.01%，可以忽略不計。上述結果表明225 nm 下硝酸益康唑及其雜質分離度良好，見表2。

表1 加雜質的樣品曲安奈德有關物質檢查結果（240 nm）

表2 加雜質的樣品益康唑有關物質結果（225 nm）

2.5.2 雜質定位 對照品溶液雜質定位結果見表3。

表3 雜質定位結果

該方法下曲安奈德和硝酸益康唑的雜質能被有效分離和檢出，方法專屬性良好。

2.6 檢測限

分別取曲安奈德對照品溶液、硝酸益康唑對照品溶液、各單個已知雜質對照品溶液，逐級稀釋，照擬定的有關物質檢查法測定，直至對應的色譜峰信噪比符合規定，見表4。

曲安奈德1%對照溶液的進樣量為0.1 μg，報告限度0.05%的進樣量為5 ng；硝酸益康唑1%對照溶液的進樣量為1 μg，報告限度0.05%的進樣量為50 ng。由上表可知，硝酸益康唑各雜質檢測限均低于報告限度，曲安奈德除雜質C 檢測限濃度約相當于0.06%外，也均低于報告限度，表明本方法能有效檢出已知雜質。

表4 檢測限結果表

2.7 樣品有關物質測定

采用主成分自身對照法測定樣品中的有關物質。取3 批樣品（30 ℃±2 ℃，65%±5% RH 加速試驗6 個月），按照“2.3”項下方法制備供試品溶液和對照溶液。取上述供試品溶液、對照溶液和“2.2”項下系統適用性溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣。結果表明，3 批樣品有關物質均符合規定，見表5。

表5 樣品有關物質測定結果

3 討論

3.1 供試品溶液濃度的確定

本品為復方制劑，曲安奈德和硝酸益康唑規格分別為0.1%和1%。查閱國內外藥典同品種質量標準獲悉，《中國藥典》（2015 年版）曲安奈德原料藥、注射劑、USP36 曲安奈德原料藥有關物質檢查項下供試品濃度均為0.5 mg/mL，進樣體積20 μL；《中國藥典》（2015 年版）、EP 8.0、BP 2013 硝酸益康唑原料藥有關物質檢查項下供試品濃度為10 mg/mL，進樣體積10 μL。為確保供試品溶液進樣質量與上述標準接近，經過實驗考察，本品取樣10 g，用甲醇20 mL 溶解，進樣體積為20 μL 時，曲安奈德和硝酸益康唑進樣質量與國內外標準相當（忽略基質體積下），且樣品前處理簡便。繼續提高濃度，樣品則無法除基質，無法操作。

3.2 供試品溶液處理方法的確定

本品首先采用加熱法提取主藥和雜質，取樣品10 g，加甲醇20 mL，在60 ℃水浴下振搖，可使膏體溶解分散均勻。冰浴30 min 后，大量基質析出，此時趁冷用濾紙濾過可有效去除基質，減小對色譜柱的損害。由于該步驟基質較多，直接用0.45 μm過濾器難以濾過，故先用濾紙過濾。

3.3 系統適用性

本品曲安奈德主要降解雜質之一為曲安西龍，為曲安奈德高溫降解產物（制劑在105 ℃加熱2 h后生成約1%），其保留時間與本品中的防腐劑苯甲酸接近，兩者最難分離（分離度約為1.5～2.0），故在系統適用性試驗中規定曲安西龍與苯甲酸色譜峰之間的分離度不低于1.5。本品中曲安奈德和硝酸益康唑濃度相差10 倍，紫外吸收光譜差別較大，曲安奈德及其主要雜質最大吸收為240 nm，硝酸益康唑及其雜質最大吸收為200 nm 左右，在225 nm 左右有肩峰。國內外藥典同品種有關物質檢查項下，《中國藥典》（2015 年版）曲安奈德原料藥、注射劑采用240 nm 作為雜質檢查波長，EP8.0 原料藥則采用254 nm 為雜質檢查波長。《中國藥典》（2015 年版）、EP8.0 和BP2013 硝酸益康唑原料藥均采用225 nm作為雜質檢查波長，制劑多未收載有關物質檢查或僅用TLC 法。因此，本品在方法開發過程中采用225、240、254 nm 三波長和190～400 nm 全波長掃描進行雜質研究。結果表明，曲安奈德在240 nm 下檢出雜質個數最多，硝酸益康唑在225 nm 下檢出雜質最多。故分別設定檢測波長225 nm（硝酸益康唑雜質）和240 nm（曲安奈德雜質）。

3.4 雜質歸屬

本品有關物質檢查方法開發過程按照復方制劑有關物質研究思路開展，采用原料藥、單方、復方進行雜質譜研究，對產品在貯藏過程中可能產生的雜質進行了歸屬。對耐用性的考察結果顯示，在確定的色譜條件下，各雜質分離良好，相對保留時間較為穩定。故采用相對保留時間法進行雜質定位。本品色譜檢查中，溶劑、輔料、主藥、雜質的出峰順序和相對保留時間詳見表6。

表6 色譜峰的出峰順序和相對保留時間

3.5 限度

曲安奈德制劑僅有BP2013 鼻噴霧劑和《中國藥典》（2015 年版）注射劑收載了有關物質檢查項，BP2013 鼻噴霧劑規定任一色譜峰不得大于1%，《中國藥典》（2015 年版）注射劑規定單雜不得過0.5%，總雜不得過1.5%。本品主要參考《中國藥典》注射劑的要求，擬定曲安奈德單雜不得過0.5%，由于本品在40 ℃加速2 月時曲安奈德總雜已經接近1.0%，故擬定總雜不得過2.0%。

硝酸益康唑制劑國內外藥典多未收載有關物質檢查項，因此主要參考原料藥有關物質限度規定［EP8.0 已知雜質不得大于0.2%，未知雜質不得過0.1%；《中國藥典》（2015 年版）單雜不得大于0.2%］，結合本品40 ℃加速2 月有關物質檢查結果（單雜0.08%，總雜0.25%），擬定為：單雜不得大于0.2%，總雜不得大于1.0%。

綜上所述，本方法靈敏、準確、專屬性強、重復性好，可用于曲安奈德益康唑乳膏中有關物質的質量控制。