K-ras誘導細胞衰老與胃癌及癌前病變關系研究

王 潔，張云清，趙 斌，尹香利,2

(1.延安大學附屬醫院，陜西 延安 716000；2.渭南市中心醫院，陜西 渭南 714000)

細胞衰老是導致衰老相關性疾病(包括慢性炎癥和腫瘤)的主要機制，通過清除衰老細胞或調控衰老相關標志物治療衰老相關性疾病和腫瘤正受到越來越多的關注。近年來，細胞培養和動物實驗相繼揭示了癌基因誘發的細胞衰老與腫瘤發生密切相關[1-5]。胃癌是全球高發腫瘤之一，嚴重威脅著人類的健康[6-9]。胃癌的發展是一個多因素、多步驟、多階段的過程，細胞衰老與細胞增殖在其中起著重要的作用，P53、P16INK4a、衰老相關的β半乳糖苷酶(SA-β-Gal)是細胞衰老過程中重要的調控因子。K-ras是RAS基因家族成員之一，與腫瘤的發展及增殖有很大關系。本研究通過觀察K-ras、P16INK4a、P53、SA-β-Gal等在胃癌及癌旁組織中的表達情況，分析K-ras能否誘導細胞衰老以及細胞衰老與癌前病變的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集延安大學附屬醫院2016—2017年具有完整手術切除記錄的138例胃管狀腺癌患者的病理樣本。其中，女性35例，男性103例；年齡38～90歲，中位年齡62歲，57例患者≤52歲，81例>52歲；57例發生于近端胃，81例發生于遠端胃；腫瘤大小>5 cm者73例，≤5 cm者65例；高分化者25例，中分化者62例，低分化者51例；pTNM分期Ⅰ-Ⅱ期67例，Ⅲ期71例；發生淋巴結轉移77例，無淋巴結轉移61例；4例查見脈管內癌栓，5例查見周圍神經侵犯。所有患者均為新診斷病例，且術前均未經過放化療及免疫治療。

1.2 主要試劑 K-ras(ab180772)、SA-β-Gal(ab4761)購自Abcam公司，P16INK4a、P53免疫組化Elivision試劑盒(2011099921H)及DAB顯色劑購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 免疫組化染色 所有標本均經4%甲醛固定，常規脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋，切片厚4 μm，檸檬酸緩沖液修復，EliVision二步法免疫組化染色所用P16INK4a、K-ras、SA-β-Gal抗體稀釋滴度為1∶100，均設陽性與陰性對照。具體步驟：逐級脫蠟水化；檸檬酸緩沖液進行抗原修復；封酶水洗；一抗室溫孵育60 min；二抗室溫孵育15 min；DAB顯色3～5 min；蘇木素復染；脫水、透明和封片。

1.4 結果判定 每切片隨機選取10個高倍視野，按視野中陽性細胞數占總細胞數的比例定義陽性與陰性。如果無陽性著色或陽性細胞數<10%，則定義為陰性染色；當陽性細胞數≥10%時，定義為陽性染色。K-ras以細胞膜和(或)細胞質出現棕黃色染色為陽性細胞；P53以細胞核出現棕黃色染色為陽性細胞；P16INK4a以細胞核和(或)細胞質出現棕黃色染色為陽性細胞；SA-β-Gal以細胞膜出現棕黃色染色為陽性細胞。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0統計學軟件對所得實驗數據進行分析。胃癌及癌前病變組織中各項檢測指標的差異、K-ras蛋白與衰老相關標記物(P16INK4a、P53、SA-β-Gal)的相關性分析采用卡方檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 胃癌及癌旁組織染色結果 HE染色結果顯示：癌旁組織中胃黏膜固有腺減少，腺體之間間距增大，間質內出現不等量的淋巴細胞浸潤，部分腺體發生了腸上皮化生，表現為慢性萎縮性胃炎(圖1A)；胃癌組織病理學表現為管狀腺癌，高、中分化腺癌腺體可見不規則的腺管結構，低分化腺癌無明顯腺管形成，癌細胞呈散在、巢狀或線狀排列，細胞異型性顯著，可見核分裂像(圖1B)。免疫組化染色結果顯示：胃管狀腺癌組織中K-ras陽性表達，呈細胞膜和(或)細胞質棕黃色染色(圖1C)；胃管狀腺癌組織中P53陽性表達，呈中-高強度細胞核棕黃色染色(圖1D)；P16INK4a蛋白陽性表達，腺管或癌細胞細胞核和(或)細胞質呈棕黃色顆粒狀染色(圖1E)；胃管狀腺癌組織中SA-β-Gal蛋白陽性表達，細胞膜呈棕黃色染色(圖1F)。

注：A為癌旁組織HE染色；B為胃管狀腺癌HE染色；C-F依次為胃管狀腺癌K-ras、P53、P16INK4a及SA-β-Gal免疫組化染色(EliVision法)

2.2 胃癌與癌旁組織K-ras表達水平比較 胃癌組織中K-ras陽性表達者132例，陽性率為95.70%，癌旁組織中K-ras陽性表達者5例，陽性率僅為3.60%，兩者比較具有統計學差異(χ2=233.77，P<0.05)。

2.3 胃癌組織中K-ras與P16INK4a、P53、SA-β-Gal相關性分析 見表1。胃癌組織中，K-ras陽性組P53、SA-β-Gal、P16INK4a陽性表達率均明顯高于K-ras陰性組(均P<0.05)，提示癌組織中K-ras基因可能誘導細胞衰老。

表1 胃癌組織中K-ras與P16INK4a、P53、SA-β-Gal相關性分析[例(%)]

2.4 癌旁組織中K-ras與P16INK4a、P53、SA-β-Gal相關性分析 見表2。癌旁組織中，K-ras陽性組P53、SA-β-Gal、P16INK4a陽性表達率均顯著高于K-ras陰性組(均P<0.05)，提示在胃癌的癌前病變中也存在由K-ras誘導的細胞衰老現象。

表2 癌旁組織中K-ras與P16INK4a、P53、SA-β-Gal相關性分析[例(%)]

3 討 論

本研究檢測了K-ras以及細胞衰老標志物P53、P16INK4a、SA-β-Gal在胃癌組織及癌前病變組織中的表達。研究結果顯示，胃癌組織K-ras的表達顯著高于癌前病變，說明癌基因K-ras的激活可能參與胃癌的發生及發展過程。此外，K-ras陽性組衰老相關指標物P53、P16INK4a、SA-β-Gal的表達均顯著高于K-ras陰性組，表明胃癌組織中的K-ras基因可以誘導細胞發生衰老。因此，K-ras相關的細胞衰老對胃癌的發生和發展具有推波助瀾的作用。

癌基因表達不斷增加及其蛋白質產物的累積與腫瘤發生、發展密切相關。研究[10]顯示，RAS、Myc等癌基因過度表達可誘發細胞衰老和(或)細胞凋亡，誘發細胞進入非增殖但可存活的衰老狀態，癌細胞可通過抑制細胞衰老或凋亡從而適應高水平的致癌信號傳導，這種現象稱為癌基因誘導的細胞衰老(OIS)。細胞衰老這一術語是Hayflick于1961年提出的，因體外細胞培養時發現細胞具有增殖極限的現象[11]。細胞衰老曾被認為是機體的一種自我防御和修復機制，原癌基因也可以激活DNA損傷反應來誘發細胞的衰老。

細胞周期抑制劑P16INK4a、P53與SA-β-Gal是常見的細胞衰老分子標志物。正常情況下，這些細胞周期抑制劑陽性表達可以通過P16INK4a/pRB、P53/P21[12]和Wnt[13]等信號通路發揮作用，進而抑制腫瘤的發生和發展。然而，當這些腫瘤抑制分子突變或失活后，若衰老細胞中受損DNA不能及時被修復，可使得部分衰老細胞獲得惡性表型，從而誘發腫瘤發生與異常增殖。盡管本研究發現胃癌及癌前病變中均存在K-ras誘發的細胞衰老，但在胃癌組織中K-ras及細胞衰老相關標志物的陽性表達率高于癌前病變，間接表明了K-ras誘導的細胞衰老在慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生等胃癌癌前病變胃黏膜腺體中持續存在，若能在合適的微觀調控作用下使這些癌前病變腺上皮細胞高表達衰老相關標記物并誘導細胞發生凋亡，則將有望將腫瘤扼殺在萌芽階段。

細胞衰老是一把雙刃劍，正常情況下體內的衰老細胞可被巨噬細胞、中性粒細胞或自然殺傷細胞清除，永久性地從細胞周期中撤離，從而阻斷了腫瘤的發生。但當這些衰老的細胞多年未被及時地清除而保持衰老狀態時，這些衰老細胞將伴隨著年齡的增長而逐漸累積，一旦有機會重新進入細胞周期，將會誘發腫瘤的發生[14]。研究[15-17]發現，細胞衰老誘導的致癌機制可能與衰老細胞產生的一系列可溶性細胞因子相關，如血管內皮生長因子(VEGF)、基質金屬蛋白酶-3(MMP-3)等，此類細胞因子免疫表型的改變可能通過上皮-間葉轉化使得腫瘤細胞的侵襲性顯著增強。鑒于此原因，未來臨床醫生除對腫瘤進行放化療外，有望通過清除機體中的衰老細胞從而達到延緩或阻止腫瘤發生與發展的目的，同時也可延長患者的壽命。積累的衰老細胞若不能及時有效地加以清除，也將有可能成為細胞惡性轉變的保護傘和屏障[18]。

綜上所述，K-ras誘導的細胞衰老與胃癌發生與發展密切相關。細胞衰老誘導腫瘤發生的雙向作用給臨床腫瘤治療工作提出了嚴峻挑戰，科技工作者要充分探索不同腫瘤中細胞衰老的形成、維持和阻斷的分子機制，為抗腫瘤治療提供合理的策略。