關節軟骨Osterix蛋白表達強度對膝關節骨性關節炎形態學變化的影響

郭鳳英，張 晨，李 燕，張晉寧，楊天翔，張博文，陳德勝，Sheraz Hassan(巴基斯坦)

(1.寧夏醫科大學基礎醫學院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫科大學臨床醫學院，寧夏 銀川 750004；3.寧夏醫科大學總醫院骨科，寧夏 銀川 750004)

膝關節骨性關節炎是中老年人多發的關節退行性疾病，其特征在于骨贅形成和關節軟骨的喪失，軟骨下骨硬化以及不同程度的滑膜組織發育不良[1-3]。在終末期，患者可出現膝關節屈曲攣縮畸形、內外翻畸形等，為常見致殘原因。Osterix蛋白是維持骨代謝平衡的重要轉錄因子，也是調節骨髓間充質干細胞(Bone marrow stromal cell，BMSC)向成骨細胞分化的重要信號轉導途徑中的關鍵蛋白，對預防和治療骨性關節炎有著重要意義[4-6]。本研究探討Osterix蛋白在關節軟骨的表達強度對膝關節骨性關節炎形態學變化的影響，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年11月1日至2020年8月31日期間在我院骨科由于膝關節骨性關節炎行全膝關節置換術治療的患者44例，其中男性21例，女性23例；平均年齡(58.62±7.14)歲；平均體重指數(25.97±5.83)kg/m2。磨損較重的一側為負重區(實驗組)，磨損較輕的一側為非負重區(對照組)。病例納入標準：①符合骨關節炎診斷標準[7]者；②有顯著臨床癥狀且有手術意愿者；③術前檢查未見手術禁忌證者；④無精神、意識障礙者；⑤簽署知情同意書者。排除標準：①膝關節畸形、小兒麻痹、滑囊炎等影響膝關節軟組織發育者；②1個月內有關節內藥物注射史者。本研究已經寧夏醫科大學總醫院科研倫理委員會批準(倫理編號：2015-019)。

1.2 研究方法

1.2.1 采集標本：選取人工全膝關節置換術中截骨去除的股骨內、外髁，經肉眼比較后區分出負重區與非負重區，將股骨髁周圍軟組織剪除后，用咬骨鉗將中央磨損嚴重部位裁切成組織塊，大小約1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm。同法剪裁非負重區軟骨較完整部位。將骨塊置于15%乙二酸四乙酸(EDTA)液中脫鈣處理，期間每3 d更換1次脫鈣液，直至針刺骨組織無明顯阻力感時取出，沖洗、脫水、包埋后切片處理。

1.2.2 蘇木素-伊紅(HE)染色：37 ℃恒溫箱溫育切片12 h，取出后分別采用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ及不同濃度乙醇脫蠟入水，然后在蘇木素染液中染色2～3 min，沖洗3遍后置入1%鹽酸乙醇中分化3 s，再次沖洗干凈后伊紅染色3～5 s，自然風干后用中性樹脂予以封固，在顯微鏡下進行觀察。

1.2.3 免疫組織化學染色：70 ℃烤箱溫育切片12 h后，使用二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，再使用蒸餾水、PBS液各漂洗3次。隨后將組織切片浸入煮沸的檸檬酸鈉緩沖液中15 min，0 ℃冷卻，H2O2浸泡10 min，PBS反復沖洗3次(注意不要將軟骨組織沖掉)，滴加Osterix一抗(批號：ab22552；美國Abcam)，于4 ℃冰箱內孵育8 h后用PBS沖洗3次，并滴加二抗山羊抗兔IgG聚合物(批號：6927-100；美國BioVision)孵育15 min，加入DAB顯色液15 s，PBS沖洗干凈后蘇木精復染5 min。隨后采用蒸餾水沖洗2次，采用1%鹽酸乙醇進行分化。再次使用蒸餾水沖洗2 min，中性樹脂封固。在40倍光鏡下每張切片隨機選取5個視野，應用Image Pro Plus 6.0軟件分析測評不同軟骨細胞中Osterix蛋白的陽性表達率。

1.3 統計學方法 選用SPSS 20.0統計學軟件對研究數據進行分析。計量資料以均數±標準差表示，比較采用LSD-t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 負重區與非負重區軟骨大體觀察 見圖1。由于骨性關節炎患者的股骨內、外側髁受力不均勻，導致兩側軟骨磨損程度不一。大體觀察下，負重區大量軟骨丟失，標本表面粗糙，軟骨下骨板暴露，色澤灰暗，甚至可見潰瘍灶形成。非負重區軟骨完整，標本表面光滑富有光澤，呈乳白色，未見潰瘍灶。

圖1 股骨遠端負重區與非負重區大體觀察

2.2 負重區與非負重區軟骨HE染色結果 見圖2。鏡下觀察可見負重區軟骨面殘缺不齊，過渡層出現裂隙，軟骨細胞分布紊亂，潮線不完整，軟骨下骨排列不均，有彌漫性增生；非負重區軟骨表面較為平整，軟骨細胞數量多，胞質完整均勻。從軟骨結構、軟骨細胞數量、軟骨基質染色以及潮線完整程度等方面對膝關節軟骨進行Mankin評分[8]，并據此將負重區分為中度磨損組(15例，7～9分)和重度磨損組(29例，10～13分)。

注：藍色剪頭所示為軟骨面

2.3 負重區與非負重區軟骨免疫組化染色結果 見圖3。Osterix蛋白主要在成骨細胞胞漿著色，在非負重區軟骨中可見呈黃褐色或棕色顆粒，負重區晚期軟骨組中Osterix蛋白著色表達較少。采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件可以得到非負重區軟骨組、負重區中度磨損組、負重區重度磨損組三組軟骨細胞中Osterix蛋白陽性表達率，分別為(15.16±7.86)%、(11.62±5.87)%和(7.12±4.33)%，三組間兩兩比較結果顯示，負重區重度磨損組Osterix蛋白陽性表達率小于中度磨損組，且兩者均小于非負重區軟骨組(均P<0.05)。

3 討 論

膝關節骨性關節炎是骨科常見的，侵及關節軟骨、滑膜的慢性疾病，隨著病變的發展，患者晚期可出現膝關節疼痛、畸形以及活動障礙，致使患者的生活質量嚴重下降[9]。現階段，確診膝關節骨性關節炎的患者多已處于病變中晚期，此時關節軟骨已存在嚴重磨損，因此現階段臨床上主要以手術作為主要的治療手段[10]。我國作為人口大國，老齡化問題突出，隨著膝關節骨性關節炎患者數量的增加，膝關節置換術的數量也逐年升高。截止到2019年，我國每年進行的膝關節置換術已超過25萬例，給社會醫療、經濟帶來了巨大壓力[11]。隨著骨性關節炎發病機制相關的分子生物學研究的不斷深入，通過生物學標志物早期診斷膝關節骨性關節炎的猜想越來越多，而尋找合適的靶點蛋白也逐漸成為了研究熱點。

Osterix是由Nakshima等[12]首先分離出來的，是Runt相關轉錄因子2(Runx2)的下游靶基因，而Runx2 為細胞外調節蛋白激酶1/2(ERK1/2)通路下游重要的靶基因之一[13]。ERK1/2活化后可激活Runx2，誘使其下游Osterix蛋白在脯氨酸-絲氨酸-蘇氨酸部位發生磷酸化，從而調控下游靶基因的表達，發揮促進成骨細胞分化的作用[14]。Osterix可以調控多種重要成骨基因的表達，如骨粘素、骨橋素、骨鈣蛋白和Ⅰ型膠原蛋白等，對骨細胞的分化成熟和軟骨細胞的修復有重要影響[15-16]，因此越來越多的人將其用于骨性關節炎的治療及診斷。Artigas等[17]表示，Osterix蛋白可作為成骨細胞分化能力的標志，其水平下降表明成骨細胞減少或分化能力降低。

膝關節軟骨的磨損退化是膝關節骨性關節炎的主要病理變化之一，也是導致關節間隙變化的原因之一。本研究通過探討不同磨損程度的軟骨與Osterix蛋白表達強度之間的關系，分析骨性關節炎中軟骨退行性變與Osterix蛋白表達的相關性。結果顯示，在長期的負重、受壓過程中，膝關節股骨髁軟骨會出現明顯磨損，在負重區會出現軟骨潰瘍、軟骨色澤及光滑度減弱等病理變化，我們猜測這些病理變化可能是受到靶點調控的結果。在通過免疫組化對不同磨損程度軟骨中Osterix蛋白表達強度進行比較后，我們發現隨著磨損程度的加重，Osterix蛋白在關節軟骨的陽性表達強度隨之減弱，二者存在負相關性，證實了在膝關節骨性關節炎軟骨退變的過程中成骨細胞的分化受到了影響。有研究[18-19]也指出，Osterix與間充質干細胞成骨分化是存在雙向調節的，可能正是由于膝關節軟骨中Osterix蛋白的下調作用致使骨髓間充質干細胞成骨化減少，減緩了軟骨細胞的修復作用，才導致關節軟骨在處于因積累性磨損、外傷導致的炎性環境中快速發生退行性變。

綜上所述，Osterix蛋白參與了關節軟骨退行性變的過程，其在軟骨細胞中的表達強度會隨著軟骨磨損程度的增加而減弱，可作為臨床上診斷膝骨性關節炎的指標之一。