生長分化因子-15在白細胞介素-1β誘導軟骨細胞凋亡與炎癥中的作用及潛在機制

梁小弟，梁小菊，李芙蓉，石茂才

(1.定西市人民醫院骨科，甘肅 定西 743000；2.西安交通大學附屬紅會醫院小兒骨科，陜西 西安 710054；3.定西市人民醫院麻醉科，甘肅 定西 743000)

骨性關節炎(Osteoarthritis,OA)是一種以年齡為主要誘因的退行性疾病，病理特點以關節軟骨的退變為主，同時滑膜和軟骨下骨發生病變[1-3]。近年來人們發現骨性關節炎也是一種炎癥性疾病[4-5]。許多炎癥因子在疾病進展中發揮著重要作用，其中白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)促進產生和釋放多種炎癥介質和代謝因子，如一氧化氮合酶(iNOS)、環氧化酶2(COX-2)、前列腺素E2(PGE2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，進而影響軟骨細胞功能。因此，抑制IL-1β及其誘導的炎癥反應可能是有效治療OA的策略[6-7]。生長分化因子-15(Growth differentiation factor-15，GDF-15)是轉化生長因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)超家族中的應激反應成員之一，已被證實參與細胞凋亡、炎癥反應及分化等各種生物學進程[8]。研究[9]發現類風濕關節炎患者血清中GDF-15水平可以作為侵蝕破壞的潛在標志。另外，GDF-15可以作為脊椎關節炎的鑒別標志物[10]。有研究[11]發現GDF-15在骨關節炎患者軟骨中的表達水平低于正常軟骨，然而GDF-15在OA發展中的具體作用仍是未知的。本研究探討GDF-15對IL-1β誘導的人膝骨性關節炎軟骨細胞凋亡和炎癥反應的影響，以期為膝骨性關節炎的治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 正常人膝關節軟骨細胞(Knee normal human articular chondrocytes,NHAC-kn)(CC-2550；美國LONZA公司)培養于含10%胎牛血清的DEME培養基中，置于含5% CO2培養箱中培養，培養箱溫度為37 ℃。

1.2 細胞活性檢測 NHAC-kn細胞接種于96孔板，密度為5×103細胞/孔。待細胞長至80%融合后，采用不同濃度的IL-1β(HEILP-0102；賽業生物)(1、5、10、15 ng/ml)處理軟骨細胞24 h，參照CCK-8試劑盒(南京凱基生物科技公司)說明書對細胞活性進行檢測。

1.3 細胞轉染 采用轉染試劑盒Lipofectamine 2000將GDF-15過表達質粒(pcDNA3.1-GDF-15；GDF-15)和空載體質粒(pcDNA3.1-NC；Vector)分別轉染到NHAC-kn細胞。24 h后，收集轉染的NHAC-kn細胞進行下一步實驗。GDF-15過表達質粒構建于武漢轉導生物實驗室。

1.4 定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測 使用上述的TRIzol試劑從軟骨細胞中提取總RNA。使用RNA逆轉錄試劑盒和cDNA合成試劑盒合成cDNA。RT-PCR采用qPCR定量試劑盒在ABI 7500 Real-time PCR儀上進行。GAPDH作為內參基因。采用2-△△CT法計算基因的相對表達量。

1.5 Western blot檢測 利用RIPA緩沖液提取總蛋白，然后使用BCA(美國Thermo Scientific公司)對蛋白進行定量檢測。取40 ng蛋白于10% SDS-PAGE凝膠電泳上進行分離后轉移至PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉3 h后，用iNOS、COX-2、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、蛋白激酶B(AKT)和p-p65、p65、NADPH的一抗4 ℃孵育過夜。隨后，在室溫下用HRP結合的二抗(南京鐘鼎生物公司)和ECL檢測系統進行檢測。

1.6 ELISA檢測 處理或未處理的軟骨細胞均勻接種于24孔板，密度為1×105細胞/孔，37 ℃條件下培養24 h。分別使用半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性測定試劑盒及NO、PGE2、IL-6和TNF-α ELISA試劑盒對相關指標進行檢測。

1.7 流式細胞術檢測 處理或未處理的軟骨細胞均勻接種于24孔板，密度為1×105細胞/孔，37 ℃條件下培養24 h。使用Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒檢測各組細胞的凋亡情況。

2 結 果

2.1 IL-1β對GDF-15 mRNA表達水平和NHAC-kn細胞活性的影響 不同濃度IL-1β(1、5、10、15 ng/ml)處理NHAC-kn細胞24 h以模擬OA的細胞模型。結果發現，與對照組(未處理)相比，IL-1β處理軟骨細胞后GDF-15 mRNA表達水平顯著下調(P<0.05)，且IL-1β濃度越高，GDF-15 mRNA表達水平越低，見圖1A。另外，IL-1β處理軟骨細胞后，細胞活性顯著下降(P<0.05)，見圖1B。

注：與對照組(Control)比較，*P<0.05

2.2 GDF-15過表達對IL-1β誘導的NHAC-kn細胞凋亡率和Caspase-3活性的影響 為了探究GDF-15在IL-1β處理的軟骨細胞中的作用，我們將GDF-15過表達質粒和空載質粒分別轉染至NHAC-kn細胞。將NHAC-kn細胞分為未處理組、IL-1β組(10 ng/ml)、IL-1β(10 ng/ml)+Vector(pcDNA3.1-NC)組、IL-1β(10 ng/ml)+GDF-15(pcDNA3.1-GDF-15)組，培養24 h。結果顯示，與IL-1β+Vector組相比，IL-1β+GDF-15組GDF-15 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖2A。另外，IL-1β處理顯著提高了軟骨細胞凋亡率和Caspase-3活性，而GDF-15過表達緩解了IL-1β誘導的細胞凋亡和Caspase-3活性升高(均P<0.05)，見圖2B、C。

注：與對照組(Control)比較，*P<0.05；與IL-1β+Vector組比較，#P<0.05

2.3 GDF-15過表達對NHAC-kn細胞NO、PGE2以及i-NOS和COX-2蛋白的影響 將NHAC-kn細胞分為未處理組、IL-1β組(10 ng/ml)、IL-1β(10 ng/ml)+Vector(pcDNA3.1-NC)組、IL-1β(10 ng/ml)+GDF-15(pcDNA3.1-GDF-15)，培養24 h。ELISA實驗結果顯示，與IL-1β+Vector組相比，IL-1β+GDF-15組細胞培養液中NO和PGE2含量均顯著降低(均P<0.05)，見圖3A、B。同樣，過表達GDF-15抑制了IL-1β誘導的軟骨細胞中iNOS和COX-2蛋白表達的上調(P<0.05)，見圖3C、D。

注：與對照組(Control)比較，*P<0.05；與IL-1β+Vector組比較，#P<0.05

2.4 GDF-15過表達對NHAC-kn細胞中及上清液中IL-6和TNF-α的影響 見圖4。IL-1β處理后顯著提高了軟骨細胞中IL-6和TNF-α轉錄水平以及上清液中IL-6和TNF-α含量，而過表達GDF-15緩解了由IL-1β引起的細胞促炎因子水平上調(均P<0.05)。

注：與對照組(Control)比較，*P<0.05；與IL-1β+Vector組比較，#P<0.05

2.5 GDF-15過表達通過PI3K/AKT/NF-κB通路抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡和炎癥反應 Western blot結果顯示，IL-1β抑制AKT磷酸化水平，促進p65磷酸化，而過表達GDF-15逆轉這種影響(P<0.05)，見圖5A-C。隨后，我們檢測了PI3K/AKT/NF-κB信號通路和GDF-15在IL-1β誘導細胞損傷中的關系，結果顯示MK-2206(PI3K/AKT信號通路特異性抑制劑)顯著抑制了GDF-15過表達對IL-1β誘導細胞凋亡和炎癥反應的保護作用(P<0.05)，見圖5D-F。

注：與IL-1β+Vector組比較，*P<0.05；與IL-1β+GDF-15組比較，#P<0.05

3 討 論

軟骨細胞是軟骨中唯一的細胞類型，一旦細胞凋亡被觸發，軟骨細胞很少能恢復[12]。軟骨細胞凋亡是OA發生、發展的重要機制。研究[13]表明，GDF-15具有抗凋亡作用。Heger等[14]研究發現，GDF-15在心力衰竭發展過程中被誘導，以減少心室心肌細胞凋亡，促進肥厚性生長。另外，血清中GDF-15的增加降低了口腔鱗狀細胞癌細胞系中Caspase-3、7的活性。本研究探究了GDF-15在IL-1β誘導的軟骨細胞損傷中的作用和機制，發現IL-1β誘導的軟骨細胞可顯著下調GDF-15轉錄水平，而GDF-15過表達明顯抑制IL-1β的促凋亡作用，減少IL-1β誘導的Caspase-3活性。這些結果在一定程度上說明GDF-15可以通過抑制凋亡來減弱IL-1β造成的軟骨損傷。

已有研究表明，炎癥細胞因子參與了OA的病理進展。作為一個關鍵炎癥因子，IL-1β被廣泛用于模擬OA微環境的體外研究[15]。本研究發現IL-1β刺激軟骨細胞增加了軟骨細胞上清液中NO和PGE2含量以及軟骨細胞中iNOS和COX-2表達，說明IL-1β可以在體外模擬OA微環境。作為一氧化氮合酶(NOS)家族中的一員，iNOS能夠合成炎癥介質NO。同樣，COX-2作為OA疼痛和炎癥的重要介質，可以產生另一種炎癥介質——PGE2[16]。研究[17]發現，在大多數OA患者中，NO和PGE2水平明顯升高，抑制其表達可以顯著延緩OA的病理過程。研究[18]表明，在急性肺損傷的小鼠中，過表達GDF-15可以抑制肝組織和血清中IL-6和TNF-α的含量以及iNOS的表達。本研究中，GDF-15過表達顯著抑制了IL-1β誘導的NO和PGE2含量及iNOS和COX-2蛋白表達，以及細胞炎癥因子IL-6和TNF-α表達水平，說明GDF-15可以通過減輕炎癥對OA起到治療作用。

研究[19]證明，IL-1β的促炎和促凋亡作用是由于激活了多個信號通路，包括p38、JNK、Wnt/β-catenin及NF-κB等，其中最重要的是NF-κB信號通路。已有文獻表明，NF-κB信號通路在OA中被激活，且在OA的發病機制中扮演著至關重要的角色。NF-κB信號通路的激活會誘發一些炎癥介質如NO、COX-2趨化因子的表達。因此，NF-κB信號通路被認為是治療OA的一個潛在的治療靶標[20]。實際上，在OA的動物和細胞模型中已經證明一些NF-κB藥理抑制劑具有保護特性[21]。PI3K/AKT信號是NF-κB信號通路上游的一個主要元素，通過抑制其活動，NF-κB磷酸化可以明顯減少[22]。還有研究[18,23]發現，GDF-15可激活PI3K/AKT信號通路，抑制NF-κB活性。本研究發現，過表達GDF-15促進IL-1β誘導的AKT磷酸化且抑制軟骨細胞凋亡以及炎癥因子、p-p65表達。另外，MK-2206(PI3K/AKT信號通路的特異性抑制劑)減少了過表達GDF-15在IL-1β誘導的軟骨細胞損傷中的修復作用。這些結果均表明GDF-15可能通過激活PI3K/AKT/NF-κB信號通路，進而緩解IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡和炎癥反應。

綜上所述，GDF-15作用于PI3K/AKT/NF-κB信號通路，可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡和炎癥反應，減少OA軟骨損傷。因此，GDF-15可能是治療OA的重要靶標。