視網(wǎng)膜前體細(xì)胞移植對(duì)缺血再灌注損傷大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)影響的實(shí)驗(yàn)研究

李雪穎，李 靜，張紅梅，周 蓉

(陜西省人民醫(yī)院，陜西 西安 710068)

缺血再灌注損傷是在缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后，組織器官損傷反而加重的現(xiàn)象[1]，是眼科常見的病理過程，常見于青光眼急性大發(fā)作降眼壓治療過程、視網(wǎng)膜血管栓塞性疾病的溶栓治療過程以及影響視網(wǎng)膜血流的各種眼科手術(shù)過程中[2]。視網(wǎng)膜缺血后再灌注可引起視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞壞死、凋亡，視網(wǎng)膜萎縮變薄[3]，也可以使Müller細(xì)胞過度活化[4]、小膠質(zhì)細(xì)胞活化以及大量炎性因子生成[5]，激活氧化應(yīng)激反應(yīng)[6]，從而造成視網(wǎng)膜損傷，導(dǎo)致嚴(yán)重的視覺障礙。視網(wǎng)膜缺血再灌注(Retinal ischemia-reperfusion，RIR)損傷指缺血性眼病患者的視網(wǎng)膜在恢復(fù)供血后出現(xiàn)明顯的功能障礙，甚至發(fā)生不可逆性損傷，再灌注并不緩解視網(wǎng)膜細(xì)胞的損傷，反而加劇了細(xì)胞的死亡[7]。目前對(duì)于視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的治療主要為輔助的藥物治療，細(xì)胞移植治療方法經(jīng)過多年研究還是處于實(shí)驗(yàn)室探索階段。本研究擬通過觀察模型大鼠視網(wǎng)膜前體細(xì)胞(Retinal progenitor cells，RPCs)移植后缺血再灌注損傷視網(wǎng)膜形態(tài)的改變，為新臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)2月齡雄性SD大鼠，體重200～250 g，無眼疾，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)保持12 h晝夜交替的生物節(jié)律，室溫保持在20～24 ℃，每日定時(shí)清洗籠舍。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物能自由飲用水和食物。將56只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(未做任何處理)、假手術(shù)組(只做前房穿刺，sham組)、前房灌注模型組(RIR組)、視網(wǎng)膜前體細(xì)胞視網(wǎng)膜下腔移植組(前房灌注后視網(wǎng)膜下腔移植視網(wǎng)膜前體細(xì)胞，RIR+R-C組)、PBS視網(wǎng)膜下腔移植組(前房灌注后視網(wǎng)膜下腔移植PBS，RIR+R-PBS組)、視網(wǎng)膜前體細(xì)胞上丘移植組(前房灌注后上丘移植視網(wǎng)膜前體細(xì)胞，RIR+SC-C組)與PBS上丘移植組(前房灌注后上丘移植PBS，RIR+SC-PBS組)，每組8只。

1.2 主要試劑 兔抗大鼠Thy-1多克隆抗體(批號(hào)：sc-9163；Santa cruz biotechnology公司)；兔抗大鼠PKC多克隆抗(批號(hào)：ab71558；Abcam公司)；小鼠抗大鼠視紫紅質(zhì)多克隆抗體(批號(hào)：ab190307；Abcam公司)；Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG；5%山羊血清；Triton X-100；甘油。

1.3 主要儀器 熒光顯微鏡(日本Olympus DP71)；Ts-2型脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；電生理儀(德國(guó)羅蘭公司)；SAE-200電子天平(德國(guó)Heraeus公司)；鼠用立體定位儀；5 μl微量注射器；微型電鉆。

1.4 細(xì)胞分離培養(yǎng) ①無菌條件下，斷頭處死新生大鼠，取頭部浸泡在盛有0.1 mol/L PBS的培養(yǎng)皿中，0.1 mol/L PBS沖洗2遍。②分離出眼球，放入含少量DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。③解剖顯微鏡下去除眼球外結(jié)締組織。④沿角鞏膜緣剪去角膜，用虹膜恢復(fù)器及鑷子小心去除晶狀體和玻璃體。⑤視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮與色素上皮層可在操作過程中自動(dòng)剝離。使用虹膜恢復(fù)器仔細(xì)剝?nèi)∫暰W(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，置于含少量完全培養(yǎng)基的小平皿內(nèi)。用小剪刀將視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層盡量剪碎成勻漿，加入少量完全培養(yǎng)基，用玻璃吸管吹打40～60次后過200目篩網(wǎng)，制成單細(xì)胞懸液。⑥用小剪刀將視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層盡量剪碎成勻漿，加入少量完全培養(yǎng)基，用玻璃吸管吹打40～60次，過200目篩網(wǎng)，制成單細(xì)胞懸液。⑦臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/ml，接種細(xì)胞懸液于培養(yǎng)瓶。于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的CO2孵育箱中培養(yǎng)，隔天加1～2 ml完全培養(yǎng)基。⑧培養(yǎng)7 d后傳代。使用玻璃吸管將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌培養(yǎng)瓶2次，將洗滌液移入離心管，1200 r/min離心5 min，棄上液后加入1 ml消化液，37 ℃孵育5 min后使用玻璃吸管吹打40次左右，再次1200 r/min離心5 min后棄上液，加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照2×105/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的CO2孵育箱中培養(yǎng)。

1.5 腺相關(guān)病毒8(Adeno-associated virus8，AAV-8)轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜前體細(xì)胞 傳代后將視網(wǎng)膜前體細(xì)胞以1×105/ml的密度接種于含完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，以1∶100的比例加入相應(yīng)的AAV-8病毒液，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的CO2孵育箱中培養(yǎng)72 h后收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，用0.01 mol/L PBS洗2次。將細(xì)胞以1×104/ml的密度接種于含完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的CO2孵育箱中培養(yǎng)7 d。

1.6 大鼠RIR損傷動(dòng)物模型制作 大鼠稱重后，給予10%水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉。麻醉后，將大鼠固定在自制載物板上。左眼局部消毒，生理鹽水與氧氟沙星眼藥水清潔結(jié)膜囊。將4.5號(hào)頭皮針自大鼠顳側(cè)角膜緣穿刺入眼前房進(jìn)行灌注，注意勿傷及虹膜和晶狀體。膠布固定穿刺針頭于定位儀上，接通預(yù)先連接好的生理鹽水輸液瓶，將輸液瓶高度升高到150 cm，壓力為150 cmH2O。觀察可見球結(jié)膜蒼白，虹膜迅速變白，生理鹽水保持角膜濕潤(rùn)。持續(xù)前房灌注加壓造成視網(wǎng)膜缺血60 min后，緩慢降壓至正常水平，拔出穿刺針頭，虹膜及球結(jié)膜顏色迅速恢復(fù)正常，結(jié)膜囊滴氧氟沙星眼藥水預(yù)防感染。松解大鼠，讓其自行蘇醒。對(duì)照組不做任何處理。

1.7 視網(wǎng)膜下腔細(xì)胞移植 將大鼠固定在自制載物板上，使術(shù)眼朝向正上方。常規(guī)表面麻醉、鋪巾，在2點(diǎn)鐘方位用顯微有齒鑷提起球結(jié)膜及其下筋膜，再用顯微剪打開一小缺口，鈍性分離球結(jié)膜及其下筋膜，暴露鞏膜；在角鞏緣后3 mm做淺層鞏膜切口(不全切透)。用5 μl顯微注射器抽取1 μl視網(wǎng)膜前體細(xì)胞懸液，將30G針頭從切口處插入視網(wǎng)膜下腔，緩緩注入1 μl視網(wǎng)膜前體細(xì)胞懸液，針頭在原地停留30 s后緩緩拔出，用棉簽按壓片刻以防止細(xì)胞懸液外漏。術(shù)后給予抗生素眼液滴眼。

1.8 上丘細(xì)胞移植 在立體定位儀上俯臥位固定麻醉后的模型大鼠。剪掉大鼠頭頂部毛發(fā)，碘伏消毒后矢狀位剪開頭皮(切口長(zhǎng)約1 cm)，去掉頭皮下疏松結(jié)締組織后用2% H2O2棉簽涂擦顱骨外膜數(shù)秒，然后用吸耳球?qū)χB骨外膜反復(fù)吹吸至前囟暴露清楚(約在兩側(cè)外眥連線中點(diǎn)處)，用簽字筆在該處做一標(biāo)記。以前囟為原點(diǎn)，在立體定位儀上移動(dòng)微量注射器向右1.5 mm，向后6 mm，在針尖相對(duì)處的顱骨表面再做一標(biāo)記，用微型電鉆在該處鉆開顱骨，深度至硬腦膜表面。用微量注射器吸取1 μl視網(wǎng)膜前體細(xì)胞懸液，向下移動(dòng)微量注射器使針尖貼在硬腦膜表面。再次確認(rèn)微量注射器針尖貼在硬腦膜表面后，開始緩慢下降微量注射器，距硬腦膜下6 mm 為注射點(diǎn)(右旁開1.5 mm，前囟后6 mm，硬腦膜下6 mm)。緩慢注射1 μl細(xì)胞懸液，留針10 min 后緩慢退針。生理鹽水沖洗切口，紅霉素軟膏封閉顱骨鉆孔，常規(guī)縫皮、消毒。

1.9 取材與觀察方法 灌注后取左眼做冰凍切片。連續(xù)切片從顳側(cè)開始，冰凍切片厚度為12 μm。不同眼球選擇相同切面通過免疫熒光染色進(jìn)行比較，染色后熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察與拍照。每個(gè)標(biāo)本選3張切片，每個(gè)切片選2個(gè)視野，測(cè)量標(biāo)本距離視盤相對(duì)一致部位的視網(wǎng)膜厚度。

2 結(jié) 果

2.1 視網(wǎng)膜前體細(xì)胞視網(wǎng)膜下腔移植后在大鼠體內(nèi)存活、遷徙與分化情況 見圖1A-D。RIR成年SD大鼠視網(wǎng)膜下腔視網(wǎng)膜前體細(xì)胞移植術(shù)后8周，可在大鼠視網(wǎng)膜的外核層觀察到表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞；細(xì)胞遷移整合到外核層并可表達(dá)視桿細(xì)胞標(biāo)識(shí)物視紫紅質(zhì)。內(nèi)核層與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層未發(fā)現(xiàn)表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞。

2.2 視網(wǎng)膜前體細(xì)胞上丘移植后在大鼠體內(nèi)存活、遷徙與分化情況 見圖1E-H。RIR成年SD大鼠上丘視網(wǎng)膜前體細(xì)胞移植術(shù)后8周，可在移植部位觀察到表達(dá)綠色熒光細(xì)胞，未發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞表達(dá)成熟視網(wǎng)膜細(xì)胞的特異性標(biāo)志物視紫紅質(zhì)，視網(wǎng)膜各層均未發(fā)現(xiàn)表達(dá)綠色熒光細(xì)胞。

A、E：視紫紅質(zhì)；B、F：DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核；C、G：綠色熒光蛋白標(biāo)記的視網(wǎng)膜前體細(xì)胞(箭頭)；D、H：對(duì)照組

2.3 視網(wǎng)膜前體細(xì)胞移植后大鼠視網(wǎng)膜厚度變化 見圖2。RIR成年SD大鼠視網(wǎng)膜下腔與上丘視網(wǎng)膜前體細(xì)胞移植術(shù)后8周，RIR組視網(wǎng)膜厚度與對(duì)照組、sham組比較均顯著降低(均P<0.001)，與RIR+SC-PBS組、RIR+R-PBS組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)；sham組視網(wǎng)膜厚度與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；RIR+SC-C組視網(wǎng)膜厚度與RIR組、RIR+SC-PBS組比較均顯著增加(均P<0.001)；RIR+R-C組視網(wǎng)膜厚度與RIR組、RIR+R-PBS組、RIR+SC-C組比較均顯著增加(均P<0.001)。

注：***P<0.001

3 討 論

上丘是大鼠視網(wǎng)膜初級(jí)投射區(qū)域，大鼠視網(wǎng)膜損傷與上丘聯(lián)系密切，而視網(wǎng)膜下腔對(duì)于移植相對(duì)豁免，因此我們的實(shí)驗(yàn)選擇視網(wǎng)膜下腔、上丘兩個(gè)部位作為移植部位，觀察視覺中樞移植與視網(wǎng)膜下腔移植對(duì)于缺血再灌注損傷視網(wǎng)膜的影響。Maclaren等[8]研究發(fā)現(xiàn)，移植的前體細(xì)胞能夠整合到宿主視網(wǎng)膜并產(chǎn)生突觸聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)傳代培養(yǎng)的第一代視網(wǎng)膜前體細(xì)胞移植到視網(wǎng)膜下腔后，這些供體細(xì)胞整合進(jìn)宿主視網(wǎng)膜外層，表達(dá)視桿細(xì)胞標(biāo)志物視紫紅質(zhì)，沒有發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜前體細(xì)胞遷移到神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層或表達(dá)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的標(biāo)志物，這與既往研究結(jié)果是一致的，移植的細(xì)胞很難分化為神經(jīng)節(jié)細(xì)胞樣神經(jīng)元[9]。

本研究中，培養(yǎng)的第一代視網(wǎng)膜前體細(xì)胞移植到上丘后，視網(wǎng)膜前體細(xì)胞能夠在上丘中存活至少8周，但是未發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞遷移到視網(wǎng)膜，這可能與觀察時(shí)間長(zhǎng)短以及視網(wǎng)膜切片的觀察范圍有關(guān)。近年研究[10]發(fā)現(xiàn)，通過激活代謝途徑能夠促進(jìn)視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的神經(jīng)分化，促進(jìn)視網(wǎng)膜前體細(xì)胞對(duì)損傷的修復(fù)。Chang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分化可以被神經(jīng)因子調(diào)控，促進(jìn)干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。Freude等[11]研究發(fā)現(xiàn)將人類誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞通過磁激活細(xì)胞分離方法可以分離出Müller祖細(xì)胞與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的祖細(xì)胞，這些特定類型細(xì)胞的移植可能更好地修復(fù)損傷的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞。后續(xù)研究也可以借助一些其他方法或途徑來幫助視網(wǎng)膜前體細(xì)胞在移植體內(nèi)遷徙與分化，達(dá)到更好的修復(fù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜前體細(xì)胞移植到視網(wǎng)膜下腔8周后，RIR+R-C組視網(wǎng)膜厚度與RIR+R-PBS、RIR+SC-C組比較均顯著增加，說明視網(wǎng)膜前體細(xì)胞視網(wǎng)膜下腔移植能夠保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞，減少視網(wǎng)膜細(xì)胞的損傷。這樣的保護(hù)作用可能與干細(xì)胞能夠產(chǎn)生生長(zhǎng)因子有關(guān)。研究[12]發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞在體內(nèi)外均可以產(chǎn)生生長(zhǎng)因子如睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)，對(duì)視網(wǎng)膜損傷具有保護(hù)作用。生長(zhǎng)因子可以通過多種途徑參與干細(xì)胞的神經(jīng)分化，影響細(xì)胞的移植率[13]。視網(wǎng)膜前體細(xì)胞移植8周后，RIR+R-C組視網(wǎng)膜厚度與RIR+SC-C組比較顯著增加，可能與移植細(xì)胞分泌的營(yíng)養(yǎng)因子有關(guān)，視網(wǎng)膜下腔移植細(xì)胞更靠近損傷的視網(wǎng)膜，移植細(xì)胞分泌的營(yíng)養(yǎng)因子能夠更早、更多地到達(dá)損傷的視網(wǎng)膜，保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞，誘導(dǎo)干細(xì)胞分化，維持視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)。

視網(wǎng)膜前體細(xì)胞移植到上丘8周后，RIR+SC-C組視網(wǎng)膜厚度與RIR+SC-PBS組比較顯著增加，說明視網(wǎng)膜前體細(xì)胞上丘移植能夠保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞，減少視網(wǎng)膜細(xì)胞的損傷。研究[14]發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜損傷能夠誘導(dǎo)視網(wǎng)膜和腦相應(yīng)區(qū)域早期和遲發(fā)的損傷。也有研究[15]發(fā)現(xiàn)，大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后3 d，可以發(fā)現(xiàn)對(duì)側(cè)外側(cè)膝狀體背側(cè)核和上丘神經(jīng)元橫截面積減少，膠質(zhì)細(xì)胞激活。視網(wǎng)膜損傷后對(duì)側(cè)外側(cè)膝狀體背側(cè)核和上丘中BDNF與神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)增加。

本研究中雖然移植后在損傷的視網(wǎng)膜未觀察到移植細(xì)胞，但移植細(xì)胞在上丘一直存活，推測(cè)存活的移植細(xì)胞可能持續(xù)分泌一些細(xì)胞因子，而細(xì)胞因子通過特殊方式作用于損傷的視網(wǎng)膜，對(duì)視網(wǎng)膜起到保護(hù)作用。