脂多糖通過NOD樣受體蛋白3炎癥小體通路誘導大鼠急性肝損傷實驗研究

黃 珊，寧佐偉，王國正，李 洋，羅曉英，金思一

(1.廣東省婦幼保健院內科重癥監(jiān)護室，廣東 廣州 511400；2.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院消化科，廣東 廣州 510515)

近年來膿毒癥造成的肝損傷逐漸引起醫(yī)生的關注[1]。肝臟在膿毒癥發(fā)生與發(fā)展過程中起著重要作用，其介導的免疫炎癥反應既能清除體內細菌與毒素，又可能導致炎癥放大、免疫抑制與器官損傷，而肝臟正是膿毒癥最常見的損傷器官[2]。膿毒癥造成肝損傷，而肝損傷又會加劇膿毒癥的嚴重程度，因此探究膿毒癥相關肝損傷的病理生理機制將有助于從相應信號通路著手研究治療膿毒癥的新策略。

脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌表達的內毒素。既往研究[3]已表明，LPS會誘導肝細胞凋亡，造成線粒體結構紊亂，導致肝細胞變性壞死，但其具體的分子機制仍有待深入探討。炎癥小體是一種多蛋白復合體，是機體免疫系統(tǒng)的組成部分，能夠識別外來病原微生物與內源性損傷等信號，從而激活下游相關靶信號，調控炎癥反應，抵抗病原體感染與應激損傷，但其在過度活化的狀況下會導致組織器官產生炎癥損傷[4]。NOD樣受體(NOD-like receptors，NLRs)是近年來臨床研究的熱點炎癥小體之一，目前對于NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體的研究較為深入，已經發(fā)現(xiàn)多種病原體及其成分均可活化NLRP3炎性復合體[5]。本研究采用不同濃度LPS刺激大鼠及肝原代細胞，探討其對肝組織的影響，并以NLRP3炎癥小體相關基因的表達情況為觀察指標，分析LPS造成急性肝細胞損傷的信號傳導機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SD大鼠購自廣東醫(yī)學實驗動物中心，動物合格證號為SYXK(粵)2019-0192，平均體重為200～300 g，分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為14～16 ℃。本研究符合一般動物學倫理要求。

1.1.2 實驗試劑：LPS(L2630)購自美國sigma公司；Hoechst 33342細胞凋亡染色試劑盒購自Sigma公司；CCK-8試劑盒購自南京固與生物；胎牛血清與DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；抗NLRP3抗體(ab214185)、抗凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)抗體、抗白介素-1β(IL-1β)抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔免疫球蛋白(IgG)購自Abcam公司；PH0722兔抗體免疫組化試劑盒購自福州飛凈生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 誘導大鼠急性肝損傷：將6只SD大鼠隨機分為對照組與LPS組，各3只。LPS組腹腔注射LPS(10 mg/kg)，對照組注射等量生理鹽水。注射24 h后抽取外周靜脈血測定肝丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶(AST)水平。取血后對所有大鼠行腹腔麻醉，取肝左葉組織以10%中性甲醛固定，脫水后以石蠟包埋切片，HE染色后置于顯微鏡下觀察。

1.2.2 免疫組化測定蛋白表達：將1.2.1中肝組織石蠟切片進行脫蠟處理，抗原修復后以3%過氧化氫溶液室溫孵育10 min，PBST沖洗3次，每次3 min。以10%山羊血清室溫孵育30 min，標本放于濕盒中，添加1∶100稀釋后的一抗4 ℃孵育過夜，PBST沖洗3 min×3次。添加生物素標記的二抗37 ℃孵育1 h，PBST沖洗3 min×3次。DAB顯色劑顯色，PBST沖洗3 min×3次。蘇木素浸泡標本3 min，去離子水沖洗3 min，脫水，透明，封片劑封片，置于顯微鏡下觀察。

1.2.3 肝原代細胞提取：取健康SD大鼠，將其麻醉后分離肝門靜脈，置入留置針，以15 ml/min速度灌注37 ℃預熱前灌液10 min。分離肝臟后灌液以5 ml/min速度灌注15 min。肝臟浸入分散液，剪去肝臟包膜，37 ℃水浴20～30 min。以70 μm篩去除雜質，留下肝細胞懸液，離心純化后得到肝原代細胞。

1.2.4 細胞培養(yǎng)與分組實驗：將1.2.3中的肝原代細胞置于37 ℃、5% CO2、濕度飽和的恒溫培養(yǎng)箱中，以含有20%胎牛血清的DEME培養(yǎng)，取對數(shù)期細胞分為空白對照組、L-LPS組與H-LPS組進行實驗。空白對照組、L-LPS組與H-LPS組細胞在饑餓后分別在含0、100、1000 ng/ml LPS的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進行后續(xù)檢測，以下每種實驗均重復3次。

1.2.4.1 增殖與凋亡測定：將各組細胞取出，每孔加入10 μl CCK試劑，于37 ℃孵育2 h，采用酶標儀檢測450 nm處吸光度(OD)，細胞增殖活力=各組OD值/對照組OD值。收集各組細胞，PBS洗滌3次后加入4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌后加入10 μg/ml Hoechst 33342避光孵育15 min，PBS洗滌后在熒光顯微鏡下觀察，每孔隨機選取5個視野，采用Image J軟件計算每張圖片在相同放大倍數(shù)下的總細胞數(shù)和Hoechst陽性細胞數(shù)，計算凋亡率。凋亡率=Hoechst陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.2.4.2 mRNA相對表達量測定：以TRIzol法提取各組細胞總RNA，以分光光度計測定RNA純度與濃度，純度合格后取1 μg總RNA進行逆轉錄，再以逆轉錄產物cDNA作為模板進行實時熒光PCR擴增，以2-△△Ct法計算相對表達含量。

1.2.4.3 蛋白質表達測定：分別提取各組細胞內總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后將其電轉至PVDF膜，完成后取出PVDF膜并以5%脫脂牛奶封閉，添加一抗(1∶1000)于4 ℃過夜，再使用HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶5000)室溫孵育1 h，清洗PVDF膜后加入顯色液，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照，軟件計算灰度值作為蛋白的表達量。

2 結 果

2.1 兩組大鼠ALT與AST水平比較 見表1。LPS組大鼠腹腔注射LPS 24 h后，ALT、AST水平均較對照組明顯升高(均P<0.05)。

表1 兩組大鼠ALT與AST水平比較(U/L)

2.2 兩組大鼠肝組織HE染色結果 見圖1。對照組中肝細胞形態(tài)正常，組織結構正常。LPS組大鼠腹腔注射LPS 24 h后，肝臟HE染色可見大量炎癥細胞浸潤，肝細胞腫脹、局灶壞死，提示LPS刺激可導致大鼠急性肝細胞損傷。

圖1 對照組(左)與LPS組(右)大鼠肝組織染色結果(HE染色，×100)

2.3 兩組大鼠肝組織NLRP3與ASC蛋白表達情況 見圖2。LPS組大鼠肝組織細胞質被染成黃褐色，表示NLRP3、ASC蛋白表達陽性，而對照組幾乎未見染色陽性細胞，提示LPS可能通過NLRP3炎癥小體通路導致急性肝細胞損傷。

A：對照組NLRP3；B：LPS組NLRP3；C：對照組ASC；D：LPS組ASC

2.4 三組肝原代細胞增殖與凋亡情況比較 見表2。與空白對照組相比，LPS刺激后肝原代細胞增殖率均有所降低，凋亡率均有所升高，且H-LPS組細胞增殖率低于L-LPS組，細胞凋亡率高于L-LPS組(均P<0.05)。

表2 三組肝原代細胞增殖與凋亡情況比較(%)

2.5 三組肝原代細胞NLRP3、ASC、IL-1β mRNA相對表達量比較 見表3。與空白對照組相比，LPS組肝原代細胞NLRP3、ASC、IL-1β mRNA相對表達量均增加，且H-LPS組均高于L-LPS組(均P<0.05)。

表3 三組肝原代細胞NLRP3、ASC、IL-1β mRNA相對表達量比較

2.6 三組肝原代細胞NLRP3、ASC、IL-1β蛋白相對表達量比較 見表4。與空白對照組相比，LPS組肝原代細胞NLRP3、ASC、IL-1β蛋白表達量均明顯增加，且H-LPS組均高于L-LPS組(均P<0.05)。

表4 三組肝原代細胞NLRP3、ASC、IL-1β蛋白相對表達量比較

3 討 論

炎癥是機體對病原菌感染與組織損傷產生的一類快速應激反應，屬于機體先天免疫過程中的一項保護措施，對于控制感染、適應性免疫、修復受損組織、維持機體穩(wěn)態(tài)均有著十分重要的意義。但它也可能導致嚴重的不良后果，如免疫功能障礙、組織損傷、器官衰竭甚至死亡，膿毒癥肝損傷便是炎癥反應過度造成的[6]。NLRs炎癥小體是炎癥反應中的重要組成部分，其中NLRP3炎癥小體信號通路是近年來臨床研究的熱點。既往研究[7-8]表明NLRP3在感染性疾病、自身免疫疾病、代謝紊亂、神經退行性疾病等均表現(xiàn)為過度激活狀態(tài)，能被多種刺激激活，包括環(huán)境因素、外源性微生物及內源性危險信號等。

本研究通過采用不同濃度革蘭氏陰性菌內毒素LPS分別刺激大鼠及肝細胞，探討LPS所致肝細胞損傷與NLRP3炎癥小體通路相關基因表達的關系，以期為膿毒癥肝損傷的治療提供新的靶點。結果顯示，與對照組相比，大鼠注射LPS 24 h后血液中轉氨酶含量明顯升高，肝組織HE染色可見大量炎癥細胞浸潤，肝細胞腫脹、局灶壞死，提示LPS刺激可導致大鼠急性肝損傷；LPS組大鼠肝組織細胞質被染成黃褐色，表示NLRP3、ASC蛋白表達陽性，而對照組幾乎未見染色陽性細胞，提示LPS可能通過NLRP3炎癥小體通路導致急性肝損傷。

本研究進一步采用LPS刺激肝原代細胞后發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，LPS處理的兩組細胞增殖率均有所降低，凋亡率均有所升高，且NLRP3、ASC、IL-1β mRNA與蛋白表達量均明顯增加，且H-LPS組細胞增殖率低于L-LPS組，細胞凋亡率高于L-LPS組，同時H-LPS組NLRP3、ASC、IL-1β蛋白表達量高于L-LPS組。相關研究[9]表明，病原微生物來源物與內源性損傷信號分子刺激均可能誘導炎性復合體裝配。當LPS刺激肝原代細胞后，細胞內發(fā)生了一系列改變(如溶酶體破裂，細胞器滲透入細胞質導致細胞膜完整性喪失，細胞氧化還原平衡被打破等)，誘導肝細胞凋亡，同時激活了NLRs信號[10-11]。NLRs信號活化后，NLRP3炎癥小體與銜接分子ASC結合成復合物，首先募集半胱氨酸蛋白酶前體并使其發(fā)生水解成為具有生物活性的成熟的半胱氨酸蛋白酶[12]。半胱氨酸蛋白酶不具備直接調控凋亡作用，但在炎癥反應與細胞凋亡中發(fā)揮關鍵作用，可通過對促炎因子前體pro-IL-1β進行剪切，使其成為成熟IL-1β并釋放，進一步放大炎癥級聯(lián)反應，誘導炎性細胞死亡[13]。潮蓉等[14]采用小鼠構建酒精性肝損傷實驗發(fā)現(xiàn)，P2X7、NLRP3、ASC、IL-1β表達明顯升高，使用P2X7特異性阻斷劑A438079后上述基因表達明顯降低，因此酒精誘導的肝損傷可能與P2X7R-NLRP3信號通路有關。Wang等[15]從不同角度揭示了細菌感染誘發(fā)肝損傷的可能機制，指出腸肝軸可能通過膽汁酸代謝連接了肝臟與腸道，膽汁酸失調導致腸道失調，革蘭陰性細菌等腸源性病原菌可通過門靜脈進入肝臟，從而激活NLRP3炎性小體，誘導促炎細胞因子產生，引發(fā)肝臟炎癥。本研究結果與上述研究具有一致性。

綜上所述，LPS刺激大鼠后造成急性肝損傷，肝酶水平急劇上升，且肝組織出現(xiàn)明顯炎癥與壞死，大鼠肝組織免疫染色及肝細胞蛋白凝膠電泳檢測均發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體蛋白表達量上升，表明其誘發(fā)肝損傷可能是通過上調肝組織中NLRP3炎癥小體通路來實現(xiàn)的。