PCSK9基因工程小鼠的飼養繁殖及鑒定

（海南省藥物研究所，海南 ?？?570311）

前蛋白轉化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）基因是 2003年被發現的一個脂質代謝調節蛋白[1]，它是哺乳動物前蛋白轉化酶家族的第九個成員，其結構組成包括信號肽、前結構域、催化結構域和 C-末端結構域[2]。PCSK9基因在肝臟、小腸及腎臟等組織中均有表達，它在膽固醇和脂質代謝過程中具有非常重要的作用[3]。研究表明，PCSK9基因參與脂質代謝主要是通過促進肝細胞的低密度脂蛋白受體 (low density lipoproteinreceptor，LDLR)的降解[4]，使血液中低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的水平上升[5]，從而引起高膽固醇血癥的發生[6-9]。因此，PCSK9是人類高膽固醇血癥的主要致病基因之一[10]。

PCSK9基因已經成為治療高膽固醇血癥的潛在靶點。PCSK9抑制劑可通過抑制或降低PCSK9基因，阻斷PCSK9介導的LDLR降解，上調細胞表面 LDLR，從而下調LDL-C的水平，有效治療高膽固醇血癥，減少心血管疾病的發生。因此，通過繁育獲得足夠數量的PCSK9基因工程小鼠疾病模型，對于開展高膽固醇血癥等心血管疾病的研究與治療具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

野生型C57BL/6小鼠和PCSK9基因工程小鼠均飼養于海南省藥物研究所實驗動物中心SPF級動物房中。

1.2 主要試劑與儀器

酚，氯仿，無水乙醇，Triton X-100，蛋白酶K，Trizma Hydrochloride Solution，2×Taq Master Mix（Dye Plus），瓊脂糖，DNA Marker，0.5×TBE 緩沖液，基因組DNA提取試劑盒。

電子分析天平，電熱恒溫水箱，PCR儀，低溫高速離心機，電泳儀，凝膠成像系統。

1.3 試驗方法

1.3.1 PCSK9基因工程小鼠的飼養與繁殖。小鼠飼養于海南省藥物研究所實驗動物中心SPF級屏障環境中，飼養溫度為 22～26 °C，相對濕度為 50%～70%，人為控制晝夜明暗交替，自由飲水和采食。飼料為Co60輻照飼料，墊料為玉米芯顆粒，飲用水經凈水器過濾處理并高壓滅菌。每天進入動物房觀察小鼠生長情況，添加飼料并更換飲水。隔天更換墊料。

初期采用基因工程小鼠的雜合子首建鼠與野生型小鼠長期合籠的方式進行繁殖，對子代小鼠通過PCR和測序進行基因型鑒定，對鑒定為陽性的小鼠采用雌雄1∶1的比例合籠，通過繁育獲得穩定遺傳的子代小鼠。子鼠出生3周后斷奶分籠飼養。

1.3.2 小鼠的基因型鑒定。鼠基因組DNA的提取。小鼠出生后7 d左右對其進行剪趾編號，剪取2～5 mm小鼠尾組織置于1.5 mL EP管中，加入300 μL含有Triton X-100和蛋白酶K的鼠尾裂解液，56°C裂解過夜。將300 μL酚氯仿顛倒混勻，12 000 rpm離心10 min，吸取上清液至新的EP管中。加入2倍體積的無水乙醇，顛倒混勻。4°C條件下，12000 rpm離心 5 min，棄去上清液。加入500 μL 70%的乙醇，洗滌 2次。4℃條件下，12000 rpm離心5min。棄去上清液并在超凈工作臺中干燥，加入預熱的ddH2O溶解即得到基因組DNA。

采用PCR反應和瓊脂糖凝膠電泳進行基因型鑒定。以基因組DNA作為模板，用于PCR擴增。上游引物為 5′-TATGTCCATGTATTCTGACAGGCT-3′， 下游引 物 為 5′-AGCTGTTGACACTCAGAAAAGCAA-3′。PCR反應采用25 uL體系進行擴增，按照試劑盒說明書上的加樣體系和PCR擴增程序進行，采用6×loading buffer終止反應，并利用2%瓊脂糖凝膠電泳的方法鑒定PCR反應產物。小鼠尾部組織瓊脂糖凝膠電泳結果顯示為在551 bp處有一條帶的即鑒定為陽性。

通過測序進行基因型鑒定。對PCR檢測結果為陽性的個體進行進一步鑒定，并根據測序結果選擇陽性個體開展后續繁育。

2 結果

2.1 小鼠基因型鑒定結果

PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。

圖1 小鼠PCR鑒定結果

經過 PCR 擴增， 1、2、6、8、18、23、27、29、30 共 9個個體可以擴增出551bp的目的條帶，鑒定結果為陽性。PCR檢測為陽性的個體的測序結果見圖2。

圖2 PCR產物測序結果

測序結果顯示，1、2、6、8、18、23、27、29、30 號個體缺失13202bp。

3 討論

由于基因工程小鼠數量較少，在傳代過程中可能造成基因的丟失或改變，因此在飼養繁育方面，其要求更高一些。要嚴格控制晝夜明暗交替的時間，同時對飼料、墊料、飲水等所有物品都必須嚴格消毒。處于哺乳期的雌性小鼠對外界環境的刺激比較敏感，光線和噪音等因素都可能導致其神經系統紊亂，進而出現食仔的現象。所以在繁育期間要盡可能地減少外界刺激，除了換水加料、更換籠具，盡量不要打擾繁育期的雌鼠?？梢悦恐芑Q雄鼠，這樣能夠增加雌鼠懷孕的幾率。對鑒定為非轉基因的仔鼠要及時淘汰，而對一些比較珍貴的基因工程小鼠可以采取保存冷凍精液和胚胎的方式進行保種。

PCR鑒定是利用基因工程小鼠基因組與野生型小鼠基因組的序列差異，以小鼠基因組DNA作為模板進行PCR，并根據凝膠電泳的條帶不同來區分不同的基因型。所提取的基因組DNA的濃度及PCR反應體系、反應條件等都可能會影響PCR的結果。對于PCR結果為陽性的小鼠，可以進一步進行測序鑒定，對測序結果為陽性的個體可以根據需要進行留種繼續繁育，或者用于后續的試驗研究。