河南地方綿羊品種LHR基因的多態性分析

邵俊紅，付俊偉，董智豪，白俊艷＊，陳夢柯，付學言，冀 祥，韓志洪，崔晗晗，彭 彬

（1.河南省汝州市動物衛生監督所，河南 汝州 467500；2.河南科技大學動物科技學院，河南 洛陽 471023）

促黃體素受體 (LHR)是屬于G蛋白偶聯受體(GPCR)超家族中的糖蛋白亞家族成員，其氨基酸序列和結構有高度同源性，具有7個跨膜區、4個胞質區以及由3個環狀區和N端組成的細胞外區，細胞外區中大約有14個不完全重復的富含亮氨酸的序列。其不但有與跨膜區發生反應后介導信號傳導的特性，而且還具有結合黃體生成素 （LH）的作用。葛立軍等[1]（2007）在多種動物包括靈長類動物、豬、牛、火雞以及人的子宮內都發現有促黃體素(LH)或人絨毛膜促性腺激素(HCG)及其mRNA的結合位點。狄冉等[2](2009)檢測了促黃體素受體(LHR)基因外顯子11在性早熟、高繁殖力山羊品種(濟寧青山羊)和性晚熟、低繁殖力品種(波爾山羊、安哥拉山羊和內蒙古絨山羊)中的單核苷酸多態性，結果發現，僅引物P3和P6的擴增片段具有多態性。申穎等[3]（2009）在探究LHR基因在濟寧青山羊發情周期的不同階段于子宮中的表達差異時，發現LHR mRNA在整個發情周期的子宮中都有表達,但各時期表達量不同。王利紅等[4]（2011）在探究綿羊促黃體素受體基因（LHR）外顯子11多態性與繁殖性能的相關性的過程中，發現設計的引物中只有兩個引物的擴增片段具有多態性。本研究將PCR-SSCP技術與測序相結合，對小尾寒羊、大尾寒羊和豫西脂尾羊的LHR基因進行種群內和種群間的多態性分析，為綿羊品種的改良和保護提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

分別采集來自濮陽的小尾寒羊、來自平頂山的大尾寒羊和來自偃師烏龍村的豫西脂尾羊的血樣，各48只，采用頸部靜脈采血方法，經抗凝處理后在冰壺中低溫保存運回實驗室，血樣于-20℃條件下保存備用。

1.2 試驗方法

引物由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成。 具體為：F:5'-TCGTTTCCTCATGTGCAATCT-3'；R:5'-GGTATGCCATCTTTCTAGTGTGAT-3'，擴增產物片段大小為200 bp。PCR反應體系的總體積為15 μL，其中 1 uL 的 DNA，上、下游引物各為 1 μL,去離子水 4.5 μL， 以及 7.5 μL 的 2×Taq PCR Green Mix。PCR 擴增程序為：94 ℃預變性 4 min，35×（94 ℃變性 40 s，58 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 80 s），72 ℃繼續延伸5 min，最后于4℃條件下保存。PCR產物經1%瓊脂糖電泳，在紫外投射儀中進行觀察，確定為陽性后在12%非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳。利用Excel軟件統計基因型頻率、基因頻率以及多態信息含量等相關指標。

2 結果與分析

2.1 綿羊LHR基因的瓊脂糖電泳結果

如圖1所示，通過梯度PCR得知，58℃是該引物的最適退火溫度。對該退火溫度下的PCR產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，結果發現特異性擴增良好，無拖尾，與預期片段大小200 bp相符，可進行SSCP分析。

圖1 綿羊 LHR基因的瓊脂糖檢測結果

2.2 綿羊LHR基因的聚丙烯酰胺凝膠電泳結果

對小尾寒羊、大尾寒羊、豫西脂尾羊促黃體素受體（LHR）外顯子11的PCR產物進行電泳，結果見圖2。可以發現，在小尾寒羊中檢測到AB、BB兩種基因型，在豫西脂尾羊中檢測到AA、AB、BB三種基因型，在大尾寒羊中檢測到AB、BB兩種基因型。

圖2 綿羊LHR基因的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

2.3 綿羊LHR基因的群體遺傳學分析

從表1可以看出，促黃體素受體（LHR）外顯子11在小尾寒羊、大尾寒羊和豫西脂尾羊中存在三種基因型，記為AA、BB和AB。其中小尾寒羊AA的基因型頻率為0.045，AB的基因型頻率為0.295，BB的基因型頻率為0.659。豫西脂尾羊AA基因型頻率為0.174，AB的基因型頻率為0.261，BB的基因型頻率為0.565。大尾寒羊AB基因頻率為0.098，BB基因頻率為0.902。促黃體素受體（LHR）外顯子11在小尾寒羊中的遺傳雜合度（He）為0.312，有效等位基因數（Ne）為 1.452，多態信息含量（PIC）為 0.263。在豫西脂尾羊中的遺傳雜合度 （He）為0.423，有效等位基因數（Ne）為 1.734，多態信息含量（PIC）為 0.256。在大尾寒羊中的遺傳雜合度 （He）為0.093，有效等位基因數（Ne）為 1.108，多態信息含量（PIC）為 0.089。

表1 綿羊LHR基因的群體多態性分析

2.4 綿羊LHR外顯子11的測序分析

選擇LHR外顯子11的AA、AB、BB這三種基因型的PCR產物直接測序，測序比對結果見圖3。發現不同基因型之間有5個位點發生突變，LHR在37位發生G、A的突變；在49位發生T、C的突變；在93位發生T、C突變；在139位發生T、G突變；在184位發生A、G突變。

圖3 綿羊LHR基因的不同基因型測序結果

3 討論

LHR基因是動物體內較為重要的調節因子之一，國內外許多學者都對其進行了研究。本研究采用PCR-SSCP技術分析了小尾寒羊、豫西脂尾羊和大尾寒羊LHR基因外顯子11的多態性，SSCP結果同樣檢測到了AA、AB、BB這三種基因型。此外，寸靜宇[5]（2019）在探究綿羊LHR基因的多態性時發現，其所探究的LHR基因7個SNPs在大多數綿羊品種中均表現為中度多態 (0.25＜PIC＜0.5)，且試驗中該基因的所有位點在各個綿羊品種中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P＞0.05)。 吳翠玲等[6]（2019）在研究新吉細毛羊中5個生殖激素受體基因的多態性時發現，LHR基因存在 T1262G、A1991G、C2012T、A2032T 和 T2041A的突變，但這些突變對其產仔數并無顯著影響 （P＞0.05）。關于其他物種，王愛華等[7]（2003）發現，豬 LHR基因外顯子11序列發生了一個堿基突變，但并沒有造成該段蛋白序列的改變，為沉默突變。以上研究都對LHR基因的SNP位點進行了部分探索，雖與本試驗研究目的不一致，但均表明LHR基因具有較高的堿基突變概率。