葫蘆素B對人MCF-7細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

黃擎擎 王丹鳳 馬 毅 田力平

(1江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所附屬江原醫(yī)院，無錫 214063；2蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，蘇州 215006)

葫蘆素B(Cucurbitacin B)是從葫蘆科植物中提取的四環(huán)三萜類化合物，是葫蘆素家族中含量最豐富的成員，具有廣泛的藥理活性，如抗炎、保肝、提高機(jī)體免疫力等作用[1-2]。葫蘆素B在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均被證實(shí)可發(fā)揮有效抗腫瘤活性，且無明顯毒副作用。本文將探討葫蘆素B對激素受體陽性的人MCF-7乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人MCF-7細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。純化葫蘆素B購自中國舜博生物工程科技公司，溶劑為二甲基亞砜(DMSO)，本實(shí)驗(yàn)所有抗體購自Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) DMEM培養(yǎng)基(美國紐約格蘭德島Gibco公司，其中含鏈霉素100U/ml、青霉素100μ/ml以抑制雜菌生長，外加10%胎牛血清適量)培養(yǎng)細(xì)胞，保持溫度37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)5%。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)胰酶消化、備用。

1.2.2SRB實(shí)驗(yàn) 備用細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液。96孔培養(yǎng)板上各滴加100μl細(xì)胞懸液，37℃，5%CO2，培養(yǎng)24h。去上清液，實(shí)驗(yàn)組分別加入20μM、50μM、100μM葫蘆素B，對照組加入等體積的DMSO。每個藥物濃度組做5個平行孔，經(jīng)48h充分反應(yīng)后三氯醋酸(中國舜博生物工程科技公司)固定。去離子水洗滌，干燥后加入0.4% SRB(中國舜博生物工程科技公司)充分反應(yīng)。10mmol/L的Tris溶液(中國舜博生物工程科技公司)加入經(jīng)醋酸洗滌的溶液中，以獲取結(jié)合型SRB。空白孔吸光度(OD)值設(shè)為零，利用酶標(biāo)儀(Amersham公司)在490nm波長下測量各組標(biāo)本OD值并計(jì)算抑制率。抑制率(%)=1-[(藥物組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%]

1.2.3Hoechst 33258凋亡實(shí)驗(yàn) 取備用細(xì)胞以4×104個/孔的密度接種于覆滅菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內(nèi)過夜。設(shè)對照組和20μM、50μM、100μM葫蘆素B組，48h后去培養(yǎng)液，固定，漂洗。移液槍移取0.5ml稀釋的Hoechst 33258溶液(上海碧云天生物科技有限公司)加入上標(biāo)本，反應(yīng)后洗滌、封片，在倒置光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)下詳細(xì)觀察記錄細(xì)胞核染色情況。

凋亡率(%)=凋亡小體個數(shù)/整張片子細(xì)胞數(shù)量×100%

1.2.4Western blotting 收集培養(yǎng)12、24h的實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞于EP管中，2500rpm離心5min，棄上清，收集細(xì)胞，PBS洗滌。加入含PMSF的細(xì)胞裂解液(上海碧云天生物科技有限公司)，輕輕吹打充分反應(yīng)后置于冰浴中30min。再次離心，上清液-20℃保存。BCA試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)檢測總蛋白濃度，調(diào)節(jié)所用標(biāo)本至相同濃度。加上樣緩沖液，按照SDS-PAGE電泳操作流程逐步進(jìn)行電泳、分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、封閉。稀釋LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62等一抗，4℃在搖床上孵育過夜，之后TBST洗膜。同樣方法孵育已做好標(biāo)記的二抗，充分反應(yīng)1h，洗膜，借助Clinx science instruments co進(jìn)行發(fā)光顯影，利用Image J Program軟件進(jìn)行圖像分析。GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 葫蘆素B對MCF-7細(xì)胞增殖活性的影響

與對照組相比，葫蘆素B各濃度組能顯著抑制人MCF-7細(xì)胞增殖，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長，對人MCF-7細(xì)胞增殖抑制作用增強(qiáng)。見圖1、表1。

圖1 葫蘆素B抑制MCF-7增殖活性

表1 各組葫蘆素B不同時(shí)間點(diǎn)對MCF-7抑制率比較

2.2 葫蘆素B對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

因6h時(shí)各濃度組增殖抑制率均無明顯變化，Hoechst 33258染色實(shí)驗(yàn)僅進(jìn)行12h、24h時(shí)的檢測。與對照組相比，葫蘆素B各濃度組能顯著增強(qiáng)人MCF-7細(xì)胞凋亡，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，且隨著藥物濃度的增加，作用時(shí)間的延長，凋亡小體明顯增多。見圖2、表2。

注：白色箭頭為凋亡小體。

表2 各組不同時(shí)間細(xì)胞凋亡率比較

2.3 葫蘆素B對MCF-7細(xì)胞自噬的影響

與對照組相比，葫蘆素B各濃度組LC3-Ⅱ表達(dá)水平顯著升高，LC3-Ⅰ、P62表達(dá)水平顯著下降(均P<0.05)。見圖3。

注：a，c為葫蘆素B作用12h，24h自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，b為a中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ對應(yīng)柱狀圖，d為c中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ對應(yīng)柱狀圖。*表示20μM組與對照組相比P<0.05，#表示50μM組與20μM組相比P<0.05、##表示100μM組與50μM組比較P<0.05。

3 討論

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性生命健康的疾病，目前發(fā)病率已居女性惡性腫瘤第一位[3-4]。化療、內(nèi)分泌治療、放療以及靶向治療可改善部分患者預(yù)后。其中Luminal亞型的乳腺癌約占乳腺癌患者70%，因激素受體表達(dá)陽性，此分子分型的患者可通過內(nèi)分泌治療藥物如三苯氧胺獲益[5]。但同其他治療方法一樣，原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥對部分患者而言不可避免。中藥提取物葫蘆素B可逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞對多柔比星的耐藥，還可抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲、誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞的凋亡[6-7]。

乳腺癌Luminal亞型常用的細(xì)胞株為MCF-7細(xì)胞株，此類細(xì)胞雖因表達(dá)雌激素受體和/或孕激素受體而預(yù)后稍好，但同樣具有癌細(xì)胞的特點(diǎn)：通過一系列分子機(jī)制改變細(xì)胞生物學(xué)行為，增強(qiáng)增殖活性，抑制凋亡、自噬。葫蘆素B是從葫蘆科植物中提取的四環(huán)三萜類化合物，Sinha等報(bào)道葫蘆素B可通過調(diào)控VEGF參與的FAK/MMP-9信號軸抑制血管的生成，從而抑制癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[8]。本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)升高葫蘆素B的濃度或延長作用時(shí)間，可明顯抑制MCF-7細(xì)胞的增殖活性。結(jié)腸癌中研究顯示葫蘆素B10μM作用24h可使細(xì)胞增殖活性下降30%[9]，本結(jié)果顯示葫蘆素B 100μM作用24h對腫瘤細(xì)胞增殖活性抑制率僅24%左右，可能與細(xì)胞株分化程度、對藥物的敏感性、所用藥物純度不同有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)觀察到葫蘆素B抗癌效果具有時(shí)間和濃度依賴性，該特征在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株中也得到證實(shí)[10]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，葫蘆素B可通過調(diào)控AKT和CDK2抑制乳腺癌細(xì)胞生長，誘導(dǎo)其凋亡，并使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期[11]。本研究中，凋亡小體的形成也證實(shí)葫蘆素B具有誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的作用，100μM組在12h和24h時(shí)凋亡率基本穩(wěn)定在13%。此外，數(shù)據(jù)表明葫蘆素B可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞中氧自由基的生成，誘導(dǎo)DNA損傷，增強(qiáng)自噬。自噬是細(xì)胞自我降解以再次利用細(xì)胞內(nèi)成分的過程，參與癌癥的發(fā)生和進(jìn)展。LC3是一種微管蛋白，自噬信號使其活化成為LC3-Ⅰ，后者再通過Atg5-Atg12-Atg16L復(fù)合物的催化反應(yīng)形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅰ與LC3-Ⅱ?qū)ψ允苫钚缘膮⒖純r(jià)值已被普遍接受。P62是自噬過程中經(jīng)典的底物蛋白，其通過與LC3相互作用使自噬溶酶體降解，P62水平隨LC3-Ⅱ表達(dá)的增高而降低。研究顯示葫蘆素B可通過調(diào)控CIP2A/PP2A/mTORC1信號軸升高自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)水平[12]。本文結(jié)果顯示隨藥物濃度及作用時(shí)間增加，LC3-Ⅱ表達(dá)水平升高，P62表達(dá)水平下降，100μM組作用12h時(shí)自噬活性基本穩(wěn)定。

葫蘆素B對乳腺癌小鼠腫瘤生長的抑制作用已經(jīng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，僅有部分病例出現(xiàn)血糖水平降低，對動物組織、器官的相關(guān)分析未見明顯毒副作用[3]。相比化療藥物及放療的毒副反應(yīng)、靶向治療費(fèi)用昂貴等缺點(diǎn)，中藥提取物葫蘆素B抑制人MCF-7細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡和自噬作用效果溫和、費(fèi)用低廉，將來有望成為乳腺癌的輔助治療藥物。