PCPA對大鼠大腦皮質P450scc、CB1R、MAP2基因表達的影響及酸棗仁湯的干預作用研究

石 鵬，滕 柳，郭海波，王 慧

(貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025)

神經甾體是一類存在于中樞或外周神經系統中，與神經系統功能密切相關的一類甾體化合物。神經甾體很早就被認為具有鎮(zhèn)靜、麻醉和抗癲癇的作用。神經甾體是神經興奮性的內源性調節(jié)因子，中樞神經系統(Central nervous system，CNS)中合成的神經甾體會通過非基因組機制影響CNS的興奮性[1]。中樞神經系統中合成神經甾體需要以膽固醇為原料，P450膽固醇側鏈裂解酶(P450 cholesterol side chain cleavage，P450scc)位于線粒體內膜，能將膽固醇催化形成孕烯醇酮(Pregnenolone，PREG)，是神經甾體合成中的限速步驟，神經甾體與細胞表面受體結合后，能快速改變神經興奮性[2]。有關研究[3]表明，大麻素受體1(Cannabinoid receptor1，CB1R)、微管相關蛋白2(Microtubule-associated protein 2，MAP2)也是神經甾體的作用靶點。CB1R在大腦中廣泛表達，PREG是CB1受體的負向別構分子，神經甾體通過CB1R與焦慮、抑郁相關。PREG通過充當激動劑與MAP2特異性結合，在腦發(fā)育、突觸可塑性、抑郁中具有一定作用[4]。目前，學界認為中樞五羥色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT)與皮層興奮性密切相關。5-HT與神經甾體均能參與中樞興奮性的調節(jié)，但二者在中樞興奮性調節(jié)中的相互作用尚不清楚。對氯苯丙氨酸(Para-chlorophenyl alanine，PCPA)是色氨酸羥化酶的不可逆抑制劑，可以有效阻斷腦內5-HT的合成，降低腦內5-HT含量，廣泛應用于睡眠-覺醒研究中[5]。酸棗仁湯(Suanzaoren decoction，SZRD)是治療失眠的經典方劑，研究顯示酸棗仁湯對參與睡眠-覺醒調節(jié)的單胺類神經遞質和氨基酸類神經遞質具有調控作用[6]。因此，本實驗通過大鼠腹腔注射PCPA，觀察大鼠腦內5-HT下降后，皮質P450scc、CB1R、MAP2 mRNA表達情況及酸棗仁湯的干預作用，探討5-HT與神經甾體的相互作用關系，揭示酸棗仁湯治療失眠的潛在機制。

1 材料與試劑

1.1 動物

健康SPF級雄性SD大鼠50只，體質量(200±20)g，購買于長沙市天勤生物技術有限公司，許可證號：NO.SCXK(湘)2014-0011。在恒溫(22±2)℃、安靜的環(huán)境中適應性喂養(yǎng)1周，實驗期間自由攝食飲水。實驗條件符合貴州中醫(yī)藥大學動物倫理和實驗相關要求。

1.2 藥物儀器及試劑

PCPA(C-6506，Sigama公司)；酸棗仁湯(酸棗仁、川芎、茯苓、知母、炙甘草)于北京同仁堂貴陽店購買；旋轉蒸發(fā)器(RE-5203，上海亞榮生化儀器廠)；7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；超微量分光光度計(德國Implen公司)；Trizol(Invitrogen公司)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒；PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(賽默飛世爾科技有限公司)，RT-PCR引物由上海生工生物技術服務有限公司合成。

2 實驗方法

2.1 藥物準備

酸棗仁湯依據第五版《方劑學》教材：稱取酸棗仁18 g，知母10 g，茯苓10 g，川芎5 g，炙甘草3 g，10劑共460 g。加8倍水浸泡1 h，煎煮1 h，紗布濾過，藥渣加入6倍水煎煮30 min過濾藥液，合并兩次藥液旋蒸濃縮至含生藥量1.5 g/mL的濃縮藥液[7]，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫R用時按需取用水浴復溫。

PCPA懸浮液配制：PCPA按350 mg/kg計算稱取用量[1]，置于研缽內間斷少量加入生理鹽水持續(xù)研磨30 min，配制成PCPA懸浮液，4 ℃保存?zhèn)溆茫褂们俺浞只靹颉?/p>

2.2 動物分組及給藥

大鼠隨機分為正常組、對照組、PCPA組、SZRD組、PCPA+SZRD組，每組10只。正常組不做任何處理，PCPA組和PCPA+SZRD組按350 mg/kg腹腔注射PCPA，對照及SZRD組腹腔注射等體積生理鹽水，每天1次持續(xù)6天。第7天起SZRD組和PCPA+SZRD組以7.5 g/kg劑量，10 mL/kg體積灌胃SZRD，對照組和PCPA組灌胃等體積生理鹽水，每天1次持續(xù)8天。

2.3 取材

末次給藥2 h后，以10%水合氯醛 (300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，冰上迅速取出腦組織，去除腦干、嗅球，分離皮質置于標記好的預冷EP管中，液氮速凍，轉入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 引物設計

引物使用Primer5.0設計，上海生工生物技術服務有限公司合成，見表1。

表1 引物序列及大小

2.5 RNA提取，逆轉錄及RT-PCR反應條件

Trizol法提取總RNA，超微量分光光度計測定RNA濃度和純度，樣本純度均符合1.8～2.0標準，隨即按照逆轉錄試劑盒要求進行逆轉錄得到cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩T-PCR參照說明書采用20 μL體系，反應條件為：UDG酶激活50 ℃ 2 min，預變性95 ℃ 2 min，變性95 ℃ 15 s，退火/延伸60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。

2.6 統計學處理

3 結果

3.1 動物一般情況

PCPA腹腔注射3天后與對照組相比可見大鼠飲食減少，白天活動增加，攻擊性增強，皮毛無光澤，出現一系列腦內5-HT濃度下降表現[1]。

3.2 PCPA對大鼠大腦皮質P450scc、CB1R、MAP2 mRNA的影響

與對照組比較，PCPA組P450scc mRNA表達增加(P<0.05)，CB1R mRNA表達下降(P<0.01)，MAP2 mRNA表達降低(P<0.05)，差異具有統計學意義，見表2。

3.3 酸棗仁湯的干預作用

與PCPA組比較，PCPA+SZRD組P450scc mRNA表達降低(P<0.05)，CB1R mRNA表達增加(P<0.05)，MAP2 mRNA表達增加(P<0.01)，差異具有統計學意義。與對照組比較，SZRD組P450scc、CB1R、MAP2 mRNA表達無統計學差異(P>0.05)，見表2。

4 討論

神經甾體及其代謝產物在皮層興奮性、學習記憶、神經保護等方面具有廣泛作用[8]。5-HT也與皮層興奮性關系密切，目前尚不明確5-HT和神經甾體間的功能關系。PCPA是研究中樞5-HT與其他神經遞質功能關系的經典藥物[9]。本實驗結果顯示(表2)，PCPA能導致大鼠大腦皮質P450scc表達增加，CB1R、MAP2表達下降，酸棗仁湯能降低P450scc表達，上調CB1R、MAP2受體表達。對照組與正常組比較，P450scc、CB1R、MAP2表達無統計學差異，表明灌胃、腹腔注射等侵襲性操作對上述指標無明顯影響。

表2 各組大鼠皮質P450scc、MAP2、CB1受體mRNA表達情況

神經甾體的合成和代謝過程需要多種酶的參與，P450scc是神經甾體生成中關鍵的酶之一[10]。星形膠質細胞、少突膠質細胞均可表達P450scc[11]，其中P450scc mRNA主要表達于星形膠質細胞中。中樞神經系統中星形膠質細胞數量眾多且分布廣泛，能調節(jié)神經元的興奮性和突觸活動，與睡眠-覺醒關系密切，在維持中樞神經系統穩(wěn)態(tài)和功能方面具有重要作用，本課題組前期研究發(fā)現，PCPA腹腔注射能激活星形膠質細胞，上調星形膠質細胞特異性標志物膠質原纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)表達[12]。還有研究[13]顯示，在癲癇的病理過程中，星形膠質細胞轉化為反應性細胞并表達高水平的P450scc，從而成為神經甾體合成的主要參與者。因此，筆者推測本實驗腹腔注射PCPA后上調的P450scc可能主要來源于激活后的反應性星形膠質細胞。另有研究[14]發(fā)現，孕期胎兒腦中具有較高濃度的神經甾體物質，使得胎兒在孕期大部分時間都處于類似睡眠的行為狀態(tài)。本實驗中大鼠腦內5-HT含量下降后，P450scc表達增加可能意味著大鼠腦內神經甾體含量的波動，這可能是導致睡眠-覺醒異常的原因，酸棗仁湯的干預作用可能是恢復腦內神經甾體水平，其具體機制還有待深入研究。

目前學界認為，神經甾體主要通過GABAA受體參與中樞神經系統興奮性的調節(jié)，神經甾體作用于GABAA受體后能使其介導的Cl-通道開放，氯離子內流增加產生抑制性電流，參與中樞興奮性的調節(jié)，使神經甾體在狂躁、焦慮、抑郁等中樞神經系統疾病的治療方面具有一定的臨床潛力[15]。CB1受體存在于GABA能和谷氨酸能神經元富集的區(qū)域且參與了信息傳遞過程，因此可以認為內源性大麻素系統能夠參與調控興奮或抑制性神經傳遞，具有雙向調控作用[16]。有關研究[17]顯示，通過CB1受體介導的內源性大麻素信號傳導對于非快速眼動睡眠的穩(wěn)定是必要的。5-HT2C受體和CB1受體之間存在相互作用從而調控大鼠睡眠-覺醒模式[18]。本實驗結果顯示，PCPA導致CB1R表達下降，這也表明5-HT與CB1R在睡眠-覺醒調節(jié)中可能也存在相互作用，酸棗仁湯可能通過增加CB1R的表達影響皮層興奮性，其中的具體機制還有待進一步研究。

MAP2是調節(jié)微管蛋白組成的重要調節(jié)因子，在穩(wěn)定微管、神經元發(fā)育、突觸可塑性等方面具有重要作用[19]。有學者[20]將MAP2作為神經元正常結構的標志物，相關研究顯示，快速眼動睡眠剝奪后大鼠皮層MAP2表達減少且能觀測到髓鞘溶解等細胞超微結構異常，本實驗的結果也發(fā)現，PCPA組與對照組比較，MAP2表達下降。筆者研究團隊前期實驗發(fā)現，PCPA能導致大鼠腦內微透析液中谷氨酸的含量增加[21]，能上調大鼠大腦皮質中代謝型谷氨酸受體mGluR1、mGluR2的表達[22]，還能增加N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體的表達[23]。因此，可推測PCPA導致MAP2表達降低的機制可能是：過度激活的NMDA和代謝型谷氨酸受體，通過Ca2+通道導致Ca2+內流增加，胞內Ca2+超載等途徑引起的細胞毒性從而導致MAP2降解。

睡眠障礙可能增加多種心血管疾病及代謝性疾病的患病風險，是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題[24]。睡眠的調節(jié)與皮層興奮性調節(jié)密切相關，探究5-HT與神經甾體的功能關系，有利于進一步明確皮層興奮性的調節(jié)機制，進而為失眠的治療提供新的治療靶點，酸棗仁湯可能通過調節(jié)P450scc、CB1R、MAP2的表達對失眠發(fā)揮治療作用，這可能是酸棗仁湯治療失眠的潛在機制之一。