放炎方對大鼠放射性肺損傷及其TGF-β1、IL-6的影響

劉 偉，蘭東強，王 柱，唐偉智，馮葉超，牛俊杰，簡小蘭

(湖南省中醫藥研究院附屬醫院，湖南 長沙 410006)

既往臨床已證實放炎方對放射性肺損傷有較好療效，具有促進炎癥吸收、改善臨床癥狀、提高患者生存質量的作用[1]。放炎方為我院中西醫結合專家蘭東強的經驗方，具有清熱養陰潤肺、活血通經化瘀的作用。本實驗通過觀察放炎方對大鼠放射性肺損傷組織病理的影響，并檢測其血清TGF-β1、IL-6含量，明確放炎方可能的作用機制，為該藥的臨床使用提供科學依據。

1 材料與試劑

1.1 動物與細胞株

大鼠，SPF級，(180±20)g，108只，購自湖南長沙斯萊克實驗動物中心，合格證號：SCXK(湘)2016-0002。

1.2 主要試劑與儀器

TGF-β1(武漢華美生物工程有限公司，批號：M22037282)，IL-6(武漢華美生物工程有限公司，批號：M20037293)；高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號：H1650R)；切片機(浙江金華益迪醫療設備有限公司，型號：YD-315)；包埋機(常州中威電子儀器有限公司，型號：BMJ-A)；全自動酶標洗板機(深圳市匯松科技發展有限公司，型號：PW-812)；多功能酶標分析儀(深圳市匯松科技發展有限公司，型號：MB-530)。

2 方法

2.1 放炎方制備

藥物組成：丹參15 g、牡丹皮15 g、當歸12 g、川芎9 g、紅景天10 g、黃芪12 g、麥冬10 g、南沙參10 g、款冬花9 g、浙貝母10 g、魚腥草15 g、桑白皮15 g、黃芩9 g、豬苓15 g、茯苓15 g、甘草5 g。藥材購自湖南省中醫藥研究院附屬醫院中藥房(顆粒劑，四川新綠藥業)，按比例加入100 ℃純凈水，使生藥濃度分別達到0.75 g/mL(低劑量組)、1.5 g/mL(中劑量組)、3 g/mL(高劑量組)，保存于4 ℃備用。地塞米松片購于湖南省中醫藥研究院附屬醫院(上海上藥信誼藥廠股份有限公司，批號：015200301，規格：0.75 mg/片，100片/盒)。

2.2 放射性肺損傷模型造模

將108只大鼠隨機分為6組，分別為空白對照組、模型組、放炎方低劑量組、放炎方中劑量組、放炎方高劑量組、陽性對照組，每組18只。空白組不進行放射線照射，其余大鼠于照射前用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后以仰臥位固定于照射臺上。調整照射野，上至大鼠前肢兩腋窩中點連線，下至胸骨劍突水平，照射面積為4 cm×4 cm，用直線加速器進行全胸單次照射，400 cGy/min，總劑量為18 Gy。麻醉后注意保暖，待大鼠自然蘇醒后，送回實驗動物中心常規飼養。

2.3 分組與給藥

大鼠均于放療后第1天給藥，每日1次，直至被處死。放炎方低、中、高劑量組：中劑量為成年人120 g/d的等效量，即10.8 g/kg，低劑量為5.4 g/kg，高劑量為21.6 g/kg，分別灌胃；陽性對照組采用地塞米松灌胃，劑量為1.04 mg/(kg·d)；空白對照組及模型組以等體積生理鹽水灌胃。

2.4 常規觀察

每天記錄大鼠精神、活動、飲食、二便、咳嗽、咳痰、照射區域毛發脫落情況，每周測定體重。記錄死亡大鼠數量。

2.5 腫瘤組織取材

大鼠飼養期間每周測定體重1次，照射后第2、4和6周為檢測節點，在檢測節點每組選取5只大鼠處死取材。取材時采用10%水合氯醛腹腔麻醉，劑量為0.3 mL/100 g，麻醉后固定在木板上，腹主動脈取血，血液樣本在4 ℃、3 000 r/min條件下離心10 min，移液器小心吸取上清液，儲存于-20 ℃冰箱。摘取右肺中葉，以4%多聚甲醛溶液固定。

2.6 肺組織病理學觀察

將固定好的右肺中葉進行常規脫水、浸蠟、包埋、切片，行HE染色，顯微鏡下觀察肺組織病理改變。

2.7 TGF-β1、IL-6檢測

采用ELISA試劑盒檢測各組大鼠血清中TGF-β1、IL-6表達水平，按試劑盒說明書操作。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 一般癥狀體征觀察

空白對照組大鼠活動反應、皮膚色澤及食量均正常，且體重增加。模型組大鼠從照射第1周開始出現食量減少、皮毛倒翻、精神萎靡、活動減少、背毛漸漸枯槁無光澤表現，在第4周、6周均有1例大鼠死亡。放炎方高、中、低劑量組大鼠精神、食量、活動度、毛發光澤度均明顯優于模型組，無明顯消瘦，無死亡。地塞米松組大鼠組精神、食量、活動度欠佳，毛發光澤度欠佳，優于模型組，但形體消瘦，第5周死亡1只。

3.2 各組大鼠肺組織病理變化

空白組大鼠未見肺部炎癥反應；各組大鼠均在第2周檢測提示明顯炎癥反應。模型組大鼠第4周炎癥反應及滲出最為顯著，第6周炎癥反應及滲出仍較明顯；地塞米松組大鼠第4、6周炎癥反應及滲出均明顯輕于模型組，第6周肺部炎癥得到明顯控制，滲出得到吸收。放炎方高、中、低劑量組大鼠第4周開始放射性肺炎反應均較模型組明顯減輕，服藥6周后，各組大鼠肺部恢復情況均優于模型組，其中高劑量組療效最優。詳見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化情況

3.3 各組大鼠TGF-β1表達情況比較

各組大鼠TGF-β1水平均在第2周開始升高，第4周達高峰，第6周開始回落。與模型組比較，放炎方低、中、高劑量組及地塞米松組大鼠血清TGF-β1水平明顯下降，差異具有顯著統計學意義(P<0.01)；高劑量組大鼠第4、6周TGF-β1水平明顯低于地塞米松組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

3.4 各組大鼠IL-6表達情況比較

各組大鼠IL-6水平均在第2周開始升高，第4周達到高峰，第6周開始回落。與模型組比較，放炎方低、中、高劑量組及地塞米松組大鼠血清IL-6含量明顯下降，差異具有顯著統計學意義(P<0.01)；放炎方高劑量組大鼠第6周IL-6水平明顯低于地塞米松組，差異具有顯著統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠IL-6表達情況比較

4 討論

放射性肺損傷是胸部腫瘤放射治療的主要并發癥之一，不僅會降低患者生活質量，還可能導致放射劑量及肺部受照范圍受限，影響臨床療效[2]，發生率約為10%～30%[3]，一般發生在放療結束后1～3個月。放射性肺纖維化是慢性放射性肺損傷的表現，一般發生于放療結束后3～6個月，甚至更長時間。放射性肺損傷的防治一直是臨床需要解決的問題。目前西醫預防性藥物主要包括細胞因子、含硫化合物和激素類藥物，效果不甚理想，且常因伴隨副反應而限制了臨床使用與推廣。因此尋找副反應小、療效較好的抗輻射藥物將有利于放射治療臨床療效的提高，意義重大。

目前公認的放射性肺損傷的發生機制為細胞因子學說，細胞、細胞因子及酶類相互作用與制約，維持放射性肺損傷發生發展過程[4]。TGF-β1、IL-6是放射性肺損傷發生發展的核心因子。放射性治療的前6個月，放療產生的氧自由基可促進TGF-β1產生，放射治療6個月以后，TGF-β1可激活成纖維細胞產生過多細胞外基質，促進肺纖維化[5-6]。王剛等[7]動態監測肺癌放療患者血漿TGF-β1水平，并觀察與放射性肺炎發生的關系，結果發現TGF-β1的動態變化與放射性肺損傷的發生及嚴重程度密切相關，TGF-β1可以作為預測因子。IL-6是一種急性反應期的炎性因子，在放射性肺損傷中水平升高。Aprin等[8]分析96例行三維適形放療的非小細胞肺癌患者的血漿IL-6和IL-10水平，發現均在放療開始后2周升高，而IL-6在放射性肺炎患者中升高尤其明顯，血漿IL-6和IL-10水平可聯合作為放射性損傷發生的預測因子。

放射性肺損傷急性期主要病理改變為炎性滲出，本研究發現放炎方各劑量組大鼠肺部病理改變均明顯輕于模型組，第6周肺組織損傷已明顯修復。放炎方各劑量組大鼠血清TGF-β1、IL-6水平在第2周明顯升高，第4周達高峰，第6周開始回落，升高強度明顯低于模型組，且高劑量組大鼠TGF-β1、IL-6水平明顯低于地塞米松組，提示放炎方能降低TGF-β1、IL-6水平，減輕肺部炎癥，減少滲出，促進肺組織修復。

根據臨床表現，放射性肺損傷屬于中醫學“肺痿”“肺痹”“喘證”等范疇。放射性肺損傷的基本病機以陰傷、氣虛為本，熱毒、血瘀為標，屬本虛標實之證，治宜清熱養陰潤肺、活血通經化瘀[9]。基于此治法，我科采用放炎方治療放射性肺損傷獲得較好臨床療效。放射性肺炎為急性病變，放炎方中丹參、川芎、牡丹皮、當歸涼血活血散瘀治其標，丹參重用為君；南沙參、麥冬、黃芪養陰清肺治其本，為臣藥；款冬花、浙川貝、桑白皮、魚腥草、黃芩清肺化痰；茯苓、豬苓益氣健脾利水滲濕；甘草調和諸藥。全方共奏清熱養陰潤肺、活血通經化瘀之功效。目前已有研究[10-11]發現中醫藥具有抗輻射作用，如補益肺氣類藥人參、黃芪、紅景天、冬蟲夏草等，活血化瘀類中藥當歸、川芎、丹參、水蛭、莪術等。充分發揮中醫藥優勢，減輕或抑制放療副反應，中西醫結合，減毒增效，將會造福更多患者。