特制接骨丸對Masquelet技術中誘導膜成骨因子表達的影響

張來福，郭紹勇，盧承印，王孝輝*

(1.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046；2.河南省洛陽正骨醫院，河南 洛陽 471002)

骨缺損在臨床中較為常見，多由創傷、感染、腫瘤切除后造成，治療中常因手術創傷大、治療周期長、并發癥多等給醫患雙方帶來不少困擾[1]。MASQUELET等[2]最早報道利用膜誘導技術治療35例骨缺損，其中骨缺損最長25cm，效果良好。Masquelet技術操作相對簡便，適應證廣泛，治療周期也不受骨缺損長度的限制，因此在臨床上得到了醫患雙方的青睞。對誘導膜的研究表明[3]，膜中包含血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、轉化生長因子β1(Transforming growth factorβ1，TGF-β1)、骨形態發生蛋白2(Bone morphogenetic protein-2，BMP-2)；其中VEGF和BMP-2可以促進骨髓干細胞的分化影響成骨過程，TGF-β1既可以影響VEGF的表達，也可以和VEGF共同影響血管的生成，誘導膜也具有一定的成骨特性。臨床發現，骨缺損修復的效果與誘導膜的活性有關，如何提高誘導膜質量，增加生長因子的表達，提升誘導膜的活性，促進骨細胞的增殖分化，成為該技術需要解決的問題[4]。本院的內部制劑特制接骨丸能促進骨折愈合，在治療骨折中后期延遲愈合或者不愈合方面具有良好效果。李陽陽等[5]報道，在脛骨橫向骨搬移中服用特制接骨丸能促進成骨及鈣化，加快骨缺損的修復。盧承印等[6]認為，特制接骨丸配合Masquelet技術能促進骨缺損的修復，可取得滿意療效。但特制接骨丸配合Masquelet技術的作用機制尚不清楚，其能否對形成的誘導膜中生長因子的表達產生影響尚不明確。因此本研究通過觀察特制接骨丸對誘導膜中VEGF、BMP-2、TGF-β1等生長因子表達的影響，來探索特制接骨丸配合Masquelet技術的作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級3月齡雄性SD大鼠48只，體質量250～270 g，購自河南省動物實驗中心[實驗動物許可證號：SYXK(豫)2015-0001]。適應性喂養1周后開始實驗。

1.2 實驗用藥與試劑

特制接骨丸[豫藥制字Z04030038，河南省洛陽正骨醫院(河南省骨科醫院)]；抗生素骨水泥(美國強生有限公司)；青霉素鈉(華北制藥)；VEGF、TGF-β1、BMP-2抗體及抗體試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及模型制作 按隨機數字表法將48只大鼠分為空白組、低劑量組、中劑量組、高劑量組4組，各12只。術區備皮，術前30 min注射青霉素鈉，采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，術區消毒、鋪巾，在脛骨結節下縱向開長約1 cm的切口，暴露脛骨，電動擺鋸截骨5 mm左右，克氏針髓內固定，骨缺損區用抗生素骨水泥填充，完全凝固后清洗縫合傷口。術后青霉素鈉腹腔注射3 d。

1.3.2 灌藥方法 將特制接骨丸與蒸餾水按不同比例混合，參照特制接骨丸(9 g/粒)的服用劑量，根據人與大鼠等效劑量的體表面積計算，得出大鼠的等效劑量為1.62 g/(kg·d)。低劑量組給予特制接骨丸1.62 g/(kg·d)，中劑量組給予4.86 g/(kg·d)，高劑量組給予14.5 8g/(kg·d)，空白對照組給予等量蒸餾水對照。術后第2天灌胃給藥，1次/d，連續4周。

1.3.3 樣本收集檢測 于原切口切開，暴露抗生素骨水泥區，骨水泥表面可見一層紅潤透明狀膜，切取膜組織，混合蛋白酶抑制劑和磷酸鹽緩沖液，放入膜組織并用離心機以12 000 r/min的轉速離心5 min，取上清液用酶聯免疫吸附測定法測定，觀察VEGF、BMP-2、TGF-β1的表達。

2 結果

2.1 模型制作

本研究所用抗生素骨水泥填塞大鼠骨缺損模型制作成功，飲食正常，大鼠傷口甲級愈合，健康存活至實驗結束，期間未出現大鼠死亡病例。模型制作情況見圖1。

圖1 抗生素骨水泥填塞大鼠骨缺損模型

2.2 實驗各組VEGF、BMP-2、TGF-β1的表達測定結果比較

給藥4周后，對各組誘導膜中VEGF、BMP-2、TGF-β1的表達測定結果進行組間比較，差異有統計學意義，P<0.05。結果顯示，實驗組VEGF、BMP-2、TGF-β1的表達均高于空白組，且高劑量組表達最明顯、中劑量組相對較弱、低劑量組次之，差異均有統計學意義，P<0.05。見表1-表3和圖2-圖4。

表1 各組誘導膜中VEGF指標比較

表2 各組誘導膜中BMP-2指標比較

表3 各組誘導膜中TGF-β1指標比較

注：紅色箭頭所指的藍色部分為細胞核，黃色箭頭所指的棕色部分為陽性表達

注：紅色箭頭所指的藍色部分為細胞核，黃色箭頭所指的棕色部分為陽性表達

注：紅色箭頭所指的藍色部分為細胞核，黃色箭頭所指的棕色部分為陽性表達

3 討論

臨床治療骨缺損時，Masquelet技術具有適應證廣泛、操作簡單且治療周期不受骨缺損長度限制等優勢，為醫患雙方所接受[7]。Masquelet技術分兩步，第一階段：骨缺損區清創徹底，植入抗生素骨水泥混合物，誘導形成纖維膜；第二階段：數周后，骨水泥周圍形成類骨膜的纖維膜，切開纖維膜，完全去除骨水泥，在膜內植入適量自體骨，固定數周，促進新骨生成，修復骨缺損。誘導膜具有類骨膜的生物學特性和獨特的結構特征，含有豐富的血管網，并且包含VEGF、BMP-2、TGF-β1等多種生長因子。研究證實[8]誘導膜中成骨因子的表達在4～6周達到峰值，為了避免藥物加速誘導膜中成骨因子達到峰值而影響結果，本研究選擇在骨水泥植入后的第4周對各組誘導膜中成骨因子表達含量進行測定。

在本研究中，高劑量組中的VEGF、TGF-β1、BMP-2因子表達最多，中劑量組、低劑量組、空白組的表達依次減少，且各組之間的差異均有統計學意義。現代研究證實[9]，VEGF是血管生成中的重要生成因子，可與血管內皮細胞的特異性受體結合，積極調控血管的生成過程。由于骨的高度血管化，VEGF在骨修復和再生中也起著重要作用，研究表明成骨細胞中VEGF水平可以為骨修復和再生提供基礎[10-12]。VEGF在整個成骨過程中有持續表達[13]，用能緩慢釋放VEGF的材料可以更好地促進骨修復[14]。TGF-β1是存儲在骨組織中最豐富的生長因子之一，能有效調節成骨細胞的增殖分化及細胞外基質的產生，通過刺激干細胞的增殖分化，加速成骨細胞的增殖，進而誘導膜內成骨以及軟骨內成骨[15]。BMP-2是轉化生長因子超家族的成員，是參加軟骨再生的主要軟骨生長因子，誘導各種類型干細胞中的軟骨形成分化及成骨的骨化[16]，既可以通過調控骨細胞中的VEGF表達，生成血管，也可以激活Smad蛋白的信號通路，促進骨髓基質細胞分化成骨細胞[17-18]。研究顯示[19]，BMP-2可增加VEGF的表達，并結合作用于成骨細胞和血管內皮細胞中，加速血管化和成骨化。誘導膜中的成骨細胞和生長因子的表達水平能影響骨細胞的增殖和骨折愈合時間，是促進移植骨形成新骨、修復骨缺損的關鍵因素之一[20]。

《素問·陰陽應象大論篇》曰：“腎生骨髓，在體為骨。”因此可從補腎強骨論治骨折或骨折不愈合。特制接骨丸，是全國名老中醫毛天東主任醫師總結出的專用于骨折中后期延遲愈合或不愈合的方劑，具有益肝腎、理氣血、強筋骨、壯元陽、填精髓的功效。方藥由黃芪、骨碎補、紅參、鹿茸、白術、山藥、杜仲、地龍、枸杞、茯苓、續斷、自然銅、三七、土鱉蟲14味中藥組成。骨折后期氣血、肝腎虧虛，治療當以補為要，方中黃芪、骨碎補為君，補氣養血、補腎強骨；紅參、自然銅為臣，益氣攝血、續筋接骨；佐余下諸藥以養氣血、補肝腎、續筋接骨。杜貴強等[21]通過對98例骨折患者進行對比治療研究，證實特制接骨丸能有效促進骨折愈合，縮短愈合周期。而特制接骨丸對于誘導膜的作用未見報道，為此我們選擇特制接骨丸進行干預Masquelet技術中誘導膜的形成實驗，以揭示特制接骨丸對誘導膜中成骨因子表達的影響。

本研究結果表明，特制接骨丸能促進誘導膜中VEGF、TGF-β1、BMP-2成骨因子的表達，且表達水平與特制接骨丸的劑量成正相關。但是，本研究僅從誘導膜生長因子表達的情況進行分析，其在二期植骨術后對骨愈合的影響效果尚需要進一步證實。