一種龜甲抗肝癌藥理作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

左蘊(yùn)澤,王 卓，周厚江，趙偉岸，南海軍*

(1.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006; 2.MRC Protein Phosphorylation & Ubiquitylation Unit University of Dundee United Kingdom；3.云浮市云安區(qū)完璧金錢龜養(yǎng)殖有限公司，廣東 云浮 527527)

龜甲，是龜科動(dòng)物烏龜(Testudinis cabapacis et plastri colia)經(jīng)剝?nèi)〕ジ猓瑫窀傻玫降谋臣谆蚋辜祝鳟a(chǎn)地在浙江、湖北、江蘇等省份。基于龜甲所制得的各類龜甲膠在歷版 《中國藥典》 均有收載，最開始記載于《本草崇源》一書，屬膠劑甲膠一類。中醫(yī)認(rèn)為龜甲膠性涼，味咸、甘，歸肝、腎、心三經(jīng)，功效滋陰潛陽[1-2]、養(yǎng)血止血，用于陰虛血虧[2]，主治陰虛潮熱、骨蒸盜汗、腰膝酸軟、血虛萎黃、崩漏帶下等證。除此外，現(xiàn)代藥理研究表明龜甲膠還有抑制腫瘤、調(diào)節(jié)代謝、提高免疫、延緩衰老等功效[3]。在當(dāng)下日益注重個(gè)人健康的時(shí)代，龜甲膠因能夠很好地改善人體陰虛虧損等健康狀態(tài)，成為繼燕窩、冬蟲夏草等之后，當(dāng)前中高端滋補(bǔ)藥材市場的主要產(chǎn)品。近年來，人們?nèi)找嬷匾晫τ邶敿啄z的炮制加工、制備工藝、有效化學(xué)成分分析、臨床藥理學(xué)等的研究[4]，龜甲膠制備工藝作為其中重要一環(huán)，也越來越得到深入的研究和探討[5]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對龜甲的潛在作用成分-靶點(diǎn)-通路進(jìn)行多層次考察，發(fā)現(xiàn)其對改善肝癌患者的術(shù)后康復(fù)及提高機(jī)體自身免疫力具有一定優(yōu)勢。龜甲作為膠類藥食同源藥材之一，其保健功能或在癌癥輔助營養(yǎng)支持康復(fù)方面具有較大的開發(fā)前景。研究通過使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法挖掘龜甲潛在的保健功能，為其在功能性食品及輔助營養(yǎng)支持方面提供理論參考依據(jù)。為龜甲膠后續(xù)開發(fā)研究提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

為了進(jìn)一步考察龜板的潛在藥理活性，本研究使用BATMAN-TCM[6]數(shù)據(jù)庫對龜板的成分及對應(yīng)的成分靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，設(shè)置條件為Score_cutoff≥20，Adjusted P-value cutoff≤0.05。同時(shí)，檢索NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得肝癌靶點(diǎn)，使用在線jvenn[7]工具獲得成分與肝癌的共同靶點(diǎn)，之后對其GO功能注釋及KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 龜甲化合物及其潛在作用靶點(diǎn)

根據(jù)Score_cutoff≥20，Adjusted P-value cutoff≤0.05條件進(jìn)行篩選，獲得龜板成分有天冬氨酸、蘇氨酸、碳酸鈣、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸等，化合對應(yīng)的成分靶點(diǎn)有283個(gè)，使用cytoscape3.7.1構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。通過分析網(wǎng)絡(luò)圖可知，龜板中存在多種氨基酸，同時(shí)可以對各靶點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控，形成了復(fù)雜的生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)。

圖1 龜甲成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.2 龜甲與肝癌共同靶點(diǎn)

以liver cancer AND Homo sapiens為關(guān)鍵詞，檢索NCBI數(shù)據(jù)庫，選擇來源OMIM數(shù)據(jù)庫，獲得471個(gè)靶點(diǎn)。經(jīng)jvenn工具分析獲得11個(gè)共同靶點(diǎn)，分別為：PTGS2、CPQ、PTK2、GLUL、MTR、GNMT、TNF、ABCB4、GATA3、FOS、JUN，見圖2。

圖2 龜板成分靶點(diǎn)-肝癌共同靶點(diǎn)

2.3 共同靶點(diǎn)GO富集分析

使用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，根據(jù)P值對細(xì)胞組成(Cellular Component，CC)、生物過程(Biological Process，BP)與分子功能(Molecular Function，MF)三個(gè)方面進(jìn)行排序，其前4富集條目見表1、圖3。分析結(jié)果可知，這些靶點(diǎn)主要涉及了蛋白激酶B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)控、轉(zhuǎn)化生長因子β受體信號通路調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)調(diào)控等，這表明龜板可能通過作用于共同靶點(diǎn)，從而直接或間接調(diào)控這些生物學(xué)功能來改善肝癌癥狀。

表1 共同靶點(diǎn)部分GO富集結(jié)果

圖3 GO富集柱狀圖

2.4 共同靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

共同靶點(diǎn)通過使用ClueGO插件進(jìn)行KEGG通路分析可知，這些靶點(diǎn)顯著富集于IL-17信號通路、肝細(xì)胞生長因子受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、NF-κB信號通路、TGF-β受體信號傳導(dǎo)、炎癥性腸病信號通路等。

3 討論

肝癌是臨床一種較為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病較為隱匿，部分患者得到確診時(shí)已處于中晚期，生存預(yù)后較差。美國癌癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)表明，2007-2016年期間，肝癌發(fā)病率仍以2%到3%速度逐年增長，其5年生存率約為18%[8]。中國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，肝癌發(fā)病率約46%，死亡率約42%，是癌癥死亡原因之一，嚴(yán)重威脅人類健康及生命安全[9]。目前肝癌常采用多種手段進(jìn)行綜合治療，如手術(shù)切除、放化療、免疫治療、中藥治療等。雖然手術(shù)治療、放化療在一定的程度上可以減緩肝癌的進(jìn)展，但是其副作用大，機(jī)體容易出現(xiàn)耐受性，長期療效及術(shù)后康復(fù)仍不容樂觀。

圖4 KEGG富集功能網(wǎng)絡(luò)圖

祖國醫(yī)學(xué)在治療肝癌方面具有獨(dú)特的療效，它可以依據(jù)肝癌患者的個(gè)體差異進(jìn)行辨癥施治，在治癌的同時(shí)兼顧人體的正氣。現(xiàn)代藥理研究表明，中醫(yī)藥對阻滯肝癌細(xì)胞周期、抑制腫瘤血管生成、信號通路調(diào)節(jié)等方面起到很大幫助[10]。而龜甲作為藥食同源膠類藥材之一，富含多種氨基酸，可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬能力[11]，在一定程度上可以加快肝癌患者的術(shù)后恢復(fù)及減輕放化療藥物的損傷，具有較好的開發(fā)前景。本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測得到了龜甲含有天冬氨酸、蘇氨酸、碳酸鈣、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸等成分。葉超平等[12]發(fā)現(xiàn)肝癌患者因肝合成功能降低、肝癌細(xì)胞分差化、腫瘤破壞肝細(xì)胞而導(dǎo)致其補(bǔ)體C3水平顯著下降，患者體液免疫機(jī)制也因此受到限制。Pan 等[13]發(fā)現(xiàn)蛋氨酸羥基類似物可以增加補(bǔ)體C3含量，同時(shí)還能下調(diào)促炎因子及上調(diào)抗炎因子的表達(dá)，增強(qiáng)免疫器官的免疫功能。蘇氨酸屬于限制性氨基酸，參與機(jī)體免疫的調(diào)控，當(dāng)體內(nèi)不足或缺乏時(shí)會(huì)抑制免疫球蛋白、T與B淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生。現(xiàn)代藥理研究表明，蘇氨酸、天冬氨酸、亮氨酸等缺乏均可以使動(dòng)物胸腺、脾臟萎縮，進(jìn)而出現(xiàn)免疫缺陷[14-]。這提示龜甲抗肝癌作用可能是通過氨基酸補(bǔ)充來恢復(fù)機(jī)體免疫功能以抑制癌癥細(xì)胞的增殖、侵襲等。中醫(yī)肝癌終末期肝腎陰虛性患者，由于津液虧虛、正氣不足，肝臟儲(chǔ)備功能較差，CD4、CD19及NK細(xì)胞值下降[156]。而龜甲為血肉有情之品，稟脾肺腎三陰之氣，大補(bǔ)真陰，破癥瘕，可通過多種氨基酸刺激機(jī)體的免疫功能來達(dá)到改善肝癌的津液虧虛、免疫低下等功效。

通過對龜甲成分靶點(diǎn)及肝癌靶點(diǎn)進(jìn)行取交集獲得PTGS2、GATA3、PTK2、TNF等靶點(diǎn)。前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(PTGS2)，又稱環(huán)氧合酶2(COX2)，是前列腺素生物合成中的關(guān)鍵酶，既是一種雙加氧酶又是一種過氧化物酶。許雅蘋等[17]發(fā)現(xiàn)肝星狀細(xì)胞 (HSC)可以調(diào)控COX2來抑制CD8、CD4免疫細(xì)胞，進(jìn)而改變機(jī)體的免疫機(jī)能，調(diào)節(jié)腫瘤生長的微環(huán)境來影響腫瘤的進(jìn)展。腫瘤壞死因子α(TNF-α)是一種重要的促炎因子，可以調(diào)節(jié)NF-κB信號通路、促進(jìn)T細(xì)胞及其他殺傷細(xì)胞及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能影響著腫瘤的發(fā)生發(fā)展[18]。研究表明，老年肝癌肝切除術(shù)患者給予腸內(nèi)營養(yǎng)支持可以降低TNF-α水平，降低體內(nèi)炎癥反應(yīng)，同時(shí)還能改善術(shù)后免疫抑制狀態(tài)，促進(jìn)患者的肝功能恢復(fù)等[19]。Fan等[20]發(fā)現(xiàn)蛋白酪氨酸激酶2(PTK2)可以通過激活Wnt/β-catenin信號通過促進(jìn)肝細(xì)胞癌(HCC)的腫瘤發(fā)生、復(fù)發(fā)、耐藥等，與肝癌總生存率及無復(fù)發(fā)生存率相關(guān)。Lin等[21]通過對肝癌患者外周血進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子GATA3基因表達(dá)水平顯著高于對照組，其過表達(dá)與Th1/Th2比例失衡相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，GATA3基因是KIAA1429介導(dǎo)的m6A修飾的直接下游靶點(diǎn)，與肝癌患者的生存預(yù)后、腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系[22]。根據(jù)本研究可推測出龜甲中成分可能是通過介導(dǎo)這些靶點(diǎn)直接或間接來改善肝癌患者的術(shù)后康復(fù)或增強(qiáng)機(jī)體自身免疫來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

通過對共同靶點(diǎn)進(jìn)行功能注釋分析及通路分析發(fā)現(xiàn)，這些靶點(diǎn)顯著富集于蛋白激酶B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)控、轉(zhuǎn)化生長因子β受體信號通路調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合等，作用通路主要為IL-17信號通路、肝細(xì)胞生長因子受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、NF-κB信號通路、TGF-β受體信號傳導(dǎo)、炎癥性腸病信號通路。現(xiàn)有研究表明，這些通路可對肝癌細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡、腫瘤血管生成、自噬、機(jī)體免疫等進(jìn)行調(diào)控[23-27]。

綜上可知，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對龜甲的潛在作用成分-靶點(diǎn)-通路進(jìn)行多層次考察發(fā)現(xiàn)其對改善肝癌患者的術(shù)后康復(fù)及提高機(jī)體自身免疫力方面具有一定優(yōu)勢。龜甲作為膠類藥食同源藥材之一，其保健功能或在癌癥輔助營養(yǎng)支持康復(fù)方面具有較大的開發(fā)前景。本研究通過使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法旨在挖掘龜甲潛在的保健功能，為其在功能性食品及輔助營養(yǎng)支持方面提供理論參考依據(jù)。