正交試驗法優選酒香附炮制工藝

王 斌，梁偉龍*，林欽賢，康志英，王其豐，郝建新，劉慶豐

(1.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510663；2.亳州市滬譙藥業有限公司，安徽 亳州 236800；3.寧夏隆德縣六盤山中藥資源開發有限公司，寧夏 固原 756300；4.四川香雪制藥有限公司，四川 南充 637000)

香附為莎草科植物莎草CyperusrotundusL.的干燥根莖，具有疏肝解郁、理氣寬中、調經止痛的功效[1]。香附含有揮發油類、黃酮類、糖類、生物堿、酚類、三萜類等化學成分[2]，其中α-香附酮能顯著抑制大鼠離體子宮肌收縮，為香附調經止痛的主要藥效成分[3]，香附乙酸乙酯提取物和水醇提取物亦有較強的藥理活性[4]。現代藥理學研究表明，香附可作用于中樞神經系統、心血管系統、消化系統，并具有雌激素樣作用和抗菌消炎作用[5]，中醫臨床應用廣泛。

目前關于香附的炮制研究以醋炙香附[6-7]、醋煮香附[8]、醋蒸香附[9]、四制香附[10]較多，酒香附的炮制研究較少。香附生品多入解表劑中，以理氣解郁為主，酒炙后能通經脈、散結滯[11]，臨床上常用于治療疝氣脹痛及小腸氣，療效確切，在山東[12]、湖南[13]、河南[14]、陜西[15]等地方炮制規范中均有收載。傳統的酒炙法是加黃酒悶潤后在鍋中炒干，炒制的火力、時間等全憑操作工的炮制經驗，具體炮制工藝參數難以量化。本研究以正交試驗設計烘烤法代替傳統的酒炙法，以α-香附酮、總黃酮、浸出物的含量為考察指標，利用綜合加權評分法對酒香附的炮制工藝進行優選，旨在實現酒香附生產工藝參數的量化。

1 儀器與材料

1.1 儀器

RHP-100型高速多功能粉碎機(浙江永康市榮浩工貿有限公司)；DHG-9245A型電熱鼓風干燥箱、HWS-28型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)；TC-15型電熱套(海寧市新華醫療器械廠)；XS-204型、MS-603S型電子天平(Mettler Toledo)；KQ-500DA型數控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；EYELA型旋轉蒸發儀(上海愛朗股份有限公司)；國標檢驗篩(新鄉市富皓機械設備有限公司)；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；DIONEX Ultimate 3000高效液相色譜儀(賽默飛)。

1.2 材料

α-香附酮(110748-201815，中國食品藥品檢定研究院，純度99.7%)；蘆丁(100080-201811，中國食品藥品檢定研究院，純度92.4%)；紹興黃酒(20181212，浙江圣塔紹興酒有限公司)；乙醇、甲醇、石油醚等均為分析純，實驗用水為超純水；香附藥材購于山東，經廣州市香雪制藥股份有限公司康志英制藥高級工程師鑒定為莎草科植物莎草CyperusrotundusL.的干燥根莖。

2 方法與結果

2.1 浸出物含量測定

按照《中國藥典》2015年版(通則2201)醇溶性浸出物測定法項下的熱浸法測定，以稀乙醇作溶劑。

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 對照品溶液制備 取蘆丁對照品適量，精密稱定，加乙醇制成每1 mL含0.1 mg對照品的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 取香附粗粉約2 g，精密稱定，加70%乙醇30 mL，加熱回流2 h，放冷，濾過，殘渣再加70%乙醇25 mL，加熱回流2次，每次1 h，濾過，合并濾液，減壓回收溶劑，用石油醚(30～60 ℃)振搖提取4次，每次40 mL，合并石油醚液，用乙酸乙酯充分洗滌4次，每次40 mL，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加70%乙醇溶解，轉移至25 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 最大吸收波長選擇 取對照品溶液、供試品溶液各2 mL，分別加入5%硝酸鈉溶液0.5 mL，10%硝酸鋁溶液0.5 mL，以相應的試劑為空白，在200～800 nm全波長下進行掃描，結果顯示對照品與供試品均在507 nm處有最大吸收，因此選擇507 nm為檢測波長。

2.2.4 線性關系考察 精密量取蘆丁對照品溶液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、5.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，依次加入5%亞硝酸鈉0.3 mL、4%氫氧化鈉4 mL，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。以相應的試劑為空白，采用紫外-可見分光光度法，于507 nm波長處分別測定吸光度，以吸光度(A)為縱坐標，濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程為A=1.141C-0.025 1，r=0.999 6，表明蘆丁在0.009 2～0.069 mg·mL-1濃度范圍內與峰面積積分呈良好的線性關系。

2.2.5 精密度考察 取蘆丁對照品溶液2 mL，按照“2.2.1”項下方法制備對照品溶液后連續測定6次，結果蘆丁吸光度RSD為0.69%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 精密稱取同一批香附粉末2 g，按照“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，測定蘆丁含量。結果6份供試品溶液中蘆丁平均含量為1.01%，RSD為0.88%，表明該方法的重復性良好。

2.2.7 穩定性考察 按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于放置0、10、20、30、45 min后測定吸光度，計算其RSD為1.65%，表明供試品溶液在45 min內基本穩定。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的香附粉末6份，每份1 g，分別加入蘆丁對照品3.0 mg，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，測定吸光度。結果6份樣品中總黃酮平均加樣回收率為99.2%，RSD為1.4%，符合規定。

2.3 α-香附酮含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：甲醇-水(72∶28)，柱溫：25 ℃，流速：1.0 mL·min-1，檢測波長：254 nm，進樣量：10 μL，理論塔板數按α-香附酮峰計算應不低于4 000。在此條件下分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL進樣分析，HPLC色譜見圖1。

A：對照品；B：供試品；C：空白

2.3.2 對照品溶液制備 取α-香附酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg對照品的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液制備 取香附粉末(過三號篩)約2 g，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加70%乙醇80 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3.4 線性關系考察 分別精密吸取α-香附酮對照品溶液1、3、5、7、10、15 μL注入色譜儀中進行分析。以α-香附酮對照品含量為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)繪制標準曲線，得到回歸方程：Y=15.137X+0.592，r=0.999 6，表明α-香附酮在0.051～0.640 μg進樣量范圍內與峰面積積分呈良好的線性關系。

2.3.5 精密度考察 精密吸取α-香附酮對照品溶液10 μL，重復進樣6次，測定峰面積，結果峰面積RSD為0.88%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩定性考察 按照“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，分別于放置0、2、4、6、8、12 h后精密吸取10 μL進樣分析，測定峰面積，結果峰面積RSD為0.94%，表明供試品溶液在12 h內基本穩定。

2.3.7 重復性考察 按照“2.3.3”項下方法平行制備供試品溶液6份，在“2.3.1”項色譜條件下進樣分析，測定峰面積。結果峰面積RSD為0.62%，表明該方法的重復性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密稱取同一批已知含量的香附粉末1 g，共6份，分別精密加入對照品溶液100 μL，按照“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，進行分析，測定結果。結果平均加樣回收率為99.2%，RSD為1.69%，符合規定。

2.4 正交試驗方案設計

查閱相關文獻，本次試驗選擇黃酒量、浸潤時間、香附粒度和烘烤溫度為考察因素，按L9(34)正交試驗表進行設計，每個實驗條件重復3次，因素水平設計見表1。本次試驗以各炮制品中α-香附酮、總黃酮、浸出物的含量為指標，利用綜合加權評分法確定最佳的炮制方法。具體權重：α-香附酮為香附調經止痛功效的主要藥效成分，權重占40%；浸出物為酒香附地方炮制規范中規定測定的項目，權重占40%；總黃酮含量權重占20%。打分方法為α-香附酮含量越高越好，故以含量最高的樣品為100分，如7號樣品為100分，則1號樣品得分為0.132 6/0.134 3×100=98.73分，浸出物、總黃酮得分計算方法與α-香附酮相同，各項試驗指標按照權重相加得分即為綜合得分。正交試驗安排及結果見表2，方差分析結果見表3。

表1 炮制工藝因素水平

表2 正交試驗安排及結果

表3 方差分析結果

由方差分析結果可以看出，因素C、D對實驗結果具有顯著性影響(P<0.05)，A、B對實驗結果影響不顯著(P>0.05)。由極值R可知，各因素作用的主次順序為D>C>B>A。按照綜合加權評分值越大越好的原則，最佳組合為A3B1C3D2，即酒香附的最佳炮制工藝為30%黃酒量，浸潤1 h，過65目篩，烘烤溫度60 ℃。

2.5 最佳工藝驗證實驗

為進一步驗證最佳工藝的可靠性、穩定性，按最佳工藝組合A3B1C3D2進行3次驗證試驗，結果見表4。從結果可知，正交試驗法優選的酒香附炮制工藝穩定可靠。

表4 驗證實驗結果 (%)

2.6 傳統酒炙法與烘烤法比較

為比較烘烤法優選的最佳工藝與傳統酒炙法制備樣品的差異，取同一批香附藥材，分別按照上述優選的最佳工藝組合和傳統酒炙法進行3次比較試驗，結果見表5。酒香附傳統酒炙法炮制工藝參照《全國中藥炮制規范》1988年版[16]：取香附碎塊或片加黃酒拌勻，悶透，置于鍋內，用文火加熱，炒干，取出放涼。每100 kg香附用黃酒20 kg。由結果可知，傳統酒炙法與烘烤法制備的樣品中α-香附酮、總黃酮的含量RSD均大于5%，差異較大，而浸出物含量變化不大。傳統酒炙法炮制的酒香附表面呈紅紫色，偶見焦斑、焦屑，而在烘烤法中由于烘烤溫度較低，無焦斑、無焦屑，外觀性狀優于傳統酒炙法。

表5 兩種炮制方法比較 (%)

3 結論與討論

本試驗參照相關文獻[17-20]，改進了紫外-可見分光光度法、HPLC法測定香附藥材中總黃酮、α-香附酮含量的方法，改進后的方法準確可靠、重復性好，可用于香附的質量評價研究，為香附多指標質量控制方法的建立提供了科學依據。

香附藥用歷史悠久，炮制方法眾多，傳統的酒炙香附采用直火炮制，炒制溫度、炒制時間等工藝參數難以量化，不易控制。本試驗以烘烤法替代傳統的酒炙法，以α-香附酮、總黃酮和浸出物的含量為考察指標，采用綜合加權評分法對各指標進行綜合分析。實驗結果表明，香附的粒度和烘烤溫度是顯著的影響因素，這可能與香附的主要藥效成分為揮發油的特性有關。結合最佳工藝驗證試驗和與傳統酒炙法的對比試驗，最終確定了酒香附的最佳炮制工藝為30%黃酒量，浸潤1 h，過65目篩，烘烤溫度60 ℃。本研究結果為酒香附炮制工藝的改進和生產工藝參數的量化奠定了基礎。