黃芪甲苷抑制放線菌素D誘導的HepG2細胞凋亡作用研究

劉松格，谷見法，潘 瓊

(鄭州市中心醫院 腫瘤內科，河南 鄭州 467000)

黃芪甲苷作為黃芪的有效成分已經被證明在多種疾病不同組織器官中可發揮顯著的藥理學作用[1]。諸多研究表明，黃芪甲苷可通過多種信號通路作用模式發揮抗炎癥、抗氧化、抗細胞凋亡等作用[2]。田彥璋等[3]研究發現，As-IV可通過下調GCS蛋白表達逆轉肝癌細胞株HepG2多藥耐藥性。王宇暉等[4]發現黃芪甲苷通過 Smads 通路抑制TGF-β1誘導足細胞凋亡。黃芪甲苷可保護受損心肌細胞線粒體，促進 TERT的表達，抑制心肌細胞凋亡，保護心肌細胞。黃芪甲苷可通過MAPK等多條細胞信號通路發揮作用調節腫瘤細胞的增殖、凋亡和遷移等[5]；但黃芪甲苷對肝癌細胞株HepG2的作用及其作用機制目前尚不清楚。

蛋白激酶C (PKC)/細胞外信號調節激酶 1/2(ERK1/2)途徑在癌細胞存活、增殖、凋亡、遷移和侵襲中有重要作用[6]。研究表明PKC蛋白過表達與腫瘤的發生發展密切相關，已被視為癌癥診斷的生物標志物，廣泛用于腫瘤的預后評估。先前的研究已經表明，抑制pKC-α的表達可以阻止A549細胞侵襲和遷移[7]。PKCs通過下游信號通路，如ERK1/2影響遷移和侵襲腫瘤細胞的相關信號蛋白的表達。腫瘤組織中ERK1/2磷酸化水平的增加與肺癌的臨床分期、侵襲和遷移密切相關，PKC-ERK1/2作為重要的調節通路可通過改變激酶磷酸化水平影響肝癌的侵襲和遷移等過程[8]。

肝細胞性肝癌是常見的惡性腫瘤之一，其死亡率占世界腫瘤死亡率的第3位，超過所有惡性腫瘤死亡率的5%，但是目前臨床上的治療結果仍然不容樂觀[9]。因此探尋更有效的治療方法非常緊迫，而傳統中藥因其固有的優點無疑是研究肝癌治療新藥物的重要資源[10]。本研究通過MTT、流式細胞術、western blot等技術研究黃芪甲苷對ActD誘導的肝癌細胞株HepG2細胞凋亡的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肝癌HepG2細胞株購自中國科學院上海生命科學院生物化學與細胞生物學研究所；DMEM培養基、胎牛血清均購于美國Gibco公司；MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)、放線菌素D、Hoechst33258和細胞裂解提取蛋白試劑盒均購于美國Sigma公司；PVDF膜購于美國Millipore公司；一抗為蛋白激酶C蛋白(PKC)、細胞外調節蛋白激酶1(ERK1)、細胞外調節蛋白激酶2(ERK2)、pERK1、pERK2蛋白和內參GAPDH(1∶10 000稀釋)均購置于英國Abcam公司；二抗為辣根過氧化物酶標記抗小鼠抗體，購于美國Santa Cruz Biotechnolog公司；增強化學發光(ECL)檢測試劑購自美國Pierce公司；細胞凋亡檢測試劑盒 Guava Nexin reagent和流式細胞儀為 Millipore公司產品。黃芪甲苷為國產分析純，由廣州威佳生物技術有限公司提供。不同濃度的放線菌素D溶解于一定量乙醇溶液中配制成不同濃度梯度的放線菌素D溶液。黃芪甲苷為白色干粉劑，不溶于水，用助溶劑羧甲基纖維素鈉(1%) 1 mL制成均勻混懸液。

1.2 細胞培養

肝癌HepG2細胞株培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中進行常規培養。

1.3 MTT實驗

將處于對數生長期的HepG2細胞稀釋至 5×103個/孔的細胞濃度，接種于96孔板，培養2天后，進行對應的藥物處理。藥物處理完畢后，各組細胞中加入終濃度為5 mg/mL的MTT溶液20 μL/孔，4 h后吸凈舊培養基，加150 μL DMSO脫色搖床震蕩10 min，490 nm波長下在酶標儀上測OD值，每組設6個復孔，重復3次。細胞存活率=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.4 Hoechst33258染色

將HepG2細胞細胞以5×104/mL接種于細胞爬片上，貼壁后采用不同濃度的AS-IV和ActD處理。染色前，PBS清洗3次，加入0.5 mL固定液固定10 min，PBS洗2次，每次3 min；加入0.5 mL Hoechst33258染色液室溫下染色5 min，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

細胞正常培養，不經過任何藥品處理作為對照組，經過終濃度為2 mg/mL的ActD處理24 h作為凋亡模型組，實驗處理組細胞經放線菌素D誘導凋亡處理24 h后，加入40 μmol/L的黃芪甲苷處理10 h；經過ActD和AS-IV處理后，胰酶消化細胞后1 000 rpm/min離心收集細胞，重懸于預冷的1×緩沖液中使其濃度約為1× 106細胞/mL。加入200 μL檢測試劑后，室溫避光反應25 min，200目濾網過濾后上機檢測。具體操作過程參照Guava Nexin reagent試劑盒說明書進行。

1.6 細胞膜蛋白和細胞質蛋白提取

將處理過的細胞分別加入5倍體積的緩沖液(含 2 mmol/L EDTA，10 mmol/L EGTA，20 mmol/L Tris/HCl pH=7.5，0.25 mol蔗糖)冰上制成勻漿，4 ℃、100 000×g離心1 h，取上清液含胞漿蛋白。沉淀加入1 mL胞膜蛋白提取液(含1% Triton×100，5 mmol/LEGTA，5 mmol/ L EDTA)，超聲粉碎后抽提半小時，4 ℃、100 000×g離心1 h，取上清液即為胞膜蛋白，采用BCA法進行蛋白定量，具體的操作方法參照參考文獻[11]。

1.7 蛋白印跡

經過一定濃度和時間的ActD和AS-IV處理后，收集各組細胞并分別提取總蛋白，以BCA法測其濃度。12%的SDS-PAGE電泳分離總蛋白后，轉印至PVDF膜上，BSA溶液室溫封閉1 h后，一抗4 ℃孵育過夜；PVDF膜以TBST溶液洗滌5 min×3次后，二抗室溫孵育1 h；TBST溶液洗膜5 min×3次后，滴加ECL發光試劑顯色，X片壓片后曝光成像。以GAPDH為內參對照。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 黃芪甲苷對HepG2細胞增殖的影響

經過0、20、40、60、80、100 μmol/L濃度的黃芪甲苷處理10 h后，通過MTT法檢測各組細胞吸光值，不同濃度處理的細胞活性，如圖1所示。隨著濃度的加大，處理同樣的時間對細胞活性的抑制作用就越強。在濃度大于40 μmol/L時，細胞活性顯著降低；選用40 μmol/L為實驗濃度，并處理0、6、12、24、36、48、60 h，檢測細胞活性變化，隨著時間的延長，同一濃度對細胞活性的影響就越大，如圖2所示。綜合以上結果，選擇濃度為40 μmol/L、處理時間為24 h作為后續實驗處理條件。

注：濃度為0、20、40、60、80、100 μmol/L的黃芪甲苷處理HepG2細胞，采用MTT法，檢測波長為490，分別檢測各組細胞活性。

注：40 μmol/L的黃芪甲苷分別處理0、6、12、24、36、48、60 h后各組細胞活性；n=6。

2.2 ActD誘導HepG2細胞凋亡與時間和劑量的關系

經過不同濃度的ActD處理后，實驗結果表明，ActD可有效誘導HepG2細胞凋亡，并且呈現一定的時間和劑量依賴性，選擇“濃度為2 μg/mL、處理時間為24 h”作為HepG2細胞凋亡的誘導條件，如圖3所示。并采用Hoechst33258染色細胞核，觀察ActD對細胞凋亡的誘導情況，如圖4所示。經過ActD處理的HepG2細胞組熒光顯微鏡圖片中出現大量凋亡小體，而正常對照組中染色的細胞核染色均勻，未見凋亡小體，凋亡小體越多說明細胞凋亡程度越高。以上結果說明“濃度為2 μg/mL、處理時間為24 h”可以有效誘導HepG2細胞凋亡。

注：不同濃度的ActD處理不同的時間后各組細胞凋亡比例，每組設置3個平行實驗。

注：Hoechst33258染色細胞核后結果，紅色箭頭指示凋亡小體。

2.3 黃芪甲苷與ActD誘導的HepG2細胞凋亡

選擇濃度為40 μmol/L的AS-Ⅳ和2 μg/mL ActD處理24 h為實驗組；不經過藥物處理的正常細胞為空白對照組。流式細胞儀檢測結果顯示，實驗組HepG2細胞凋亡率為8%，顯著低于ActD誘導組(27%)，P<0.05，但實驗處理組的細胞凋亡率仍顯著高于空白對照組。以上結果表明，一定濃度的黃芪甲苷可有效抑制ActD誘導的HepG2細胞凋亡。

2.4 黃芪甲苷與PKC/ERK通路發揮的抑制細胞凋亡作用

經AS-IV和ActD處理后，分別提取每組細胞的細胞膜蛋白和細胞質蛋白。Western blot結果表明，As-IV和ActD共同處理組細胞膜PKC-α蛋白表達量顯著低于ActD處理組(P<0.01)，As-IV可顯著降低細胞膜PKC-α表達量。而在細胞質中，As-IV和ActD共同處理組細胞質PKC-α蛋白表達量顯著高于ActD處理組(P<0.01)，As-IV處理組細胞質PKC-α表達量顯著高于空白對照組和ActD處理組(P<0.05)。另一方面，As-IV處理組p-ERK1/2表達量顯著低于空白對照組，As-IV和ActD共同處理組p-ERK1/2表達量顯著低于ActD處理組。ERK1/2呈相反趨勢，如圖5所示。

注：圖片從上到下依次表示：AS-IV和ActD處理對PKC/ERK通路相關蛋白表達的影響；以及細胞質PKC-α、細胞膜PKC-α、p-ERK1/2、ERK1/2相對于對照組的灰度值。

3 討論

近些年來，腫瘤的臨床診斷和治療手段都取得了長足進步，但是隨著各種癌癥發病率的升高，腫瘤開始逐步成為一種影響人們健康的常見疾病。隨著對腫瘤發病機制的深入研究，一批又一批的腫瘤特效化療藥物正不斷地影響著腫瘤的治療效果。近年來，國內外諸多實驗發現，中藥中存在著某些特效成分，可有效抑制腫瘤的發生與發展，引起了各界的廣泛關注。有研究表明，黃芪中含有的黃芪多糖、黃酮和氨基酸等具有抗腫瘤、調節免疫力和抗氧化等藥理作用，目前已廣泛應用于臨床醫學的多個領域[11]。一般認為黃芪中的有效成分主要是皂苷，其中黃芪甲苷的作用受到了各方肯定。

實驗研究表明，黃芪甲苷可通過Smad、MAPK等信號通路發揮非特異免疫調節作用和腫瘤抑制作用，但是對于黃芪甲苷對肝癌細胞的作用及其作用機制目前尚無相關報道[12]。本研究選用HepG2細胞作為肝癌細胞模型，采用不同濃度的黃芪甲苷刺激肝癌細胞，采用MTT法，流式細胞術等實驗驗證發現黃芪甲苷對肝癌細胞活性的影響呈現時間和劑量依賴性，黃芪甲苷濃度越高，作用的時間越長，對肝癌細胞活性的抑制作用就越明顯。但在40 μmol/L濃度以下作用24 h對細胞活性無明顯影響，可作為后續作用的處理條件。根據參考文獻[13]，采用不同濃度的放線菌素D誘導肝癌細胞凋亡，Hoechst33258染色和流式細胞術結果表明，2 μg/mL ActD處理時間為24 h，可有效誘導肝癌細胞凋亡。隨后采用40 μmol/L黃芪甲苷作用24 h觀察細胞凋亡情況，實驗結果表明黃芪甲苷可有效抑制放線菌素D誘導的肝癌細胞凋亡。相對于黃芪甲苷處理組和放線菌素D處理組，采用western blot實驗證實放線菌素D處理后經過黃芪甲苷的作用可以有效抑制細胞膜PKCα蛋白和p-ERK1/2表達，而細胞質PKC-α和ERK1/2表達量顯著升高。細胞中PKC-α活化后，PKC-α會從細胞質中移位到細胞膜中，細胞膜PKC-α的增加進一步激活MAPK通路，其中MAPK通路已知廣泛參與了細胞的增殖、凋亡、炎癥和氧化應激等過程。結果表明，黃芪甲苷可有效抑制細胞質PKC-α向細胞膜轉移，抑制了細胞膜PKC-α的活化，從而進一步抑制下游ERK通路表達。實驗證實黃芪甲苷可有效抑制p-ERK1/2表達，從而抑制了細胞的凋亡和侵襲等過程。

已有研究表明，黃芪甲苷在不同的組織器官中具有不同的藥理作用。羅永姣等[14]研究發現，黃芪甲苷可有效抑制病毒性心肌炎發生過程中的心肌細胞凋亡，且已證明與促進Bcl-2抑制Bax表達有關。在腎病模型中，ZHENG等[15]研究發現，黃芪甲苷可通過抑制JNK和ERK1/2激活，保護補體膜攻擊復合物誘導的足細胞損傷。LIU等[16]研究發現，黃芪甲苷可顯著抑制豬血清誘導的肝細胞纖維化，并抑制膠原合成和肝星狀細胞增生。

目前多數研究認為PKC在細胞中通常以無活性的方式存在于細胞質中，細胞外信號分子通過偶聯蛋白活化磷脂酶 C導致三磷酸肌醇含量升高，使得Ca2+濃度升高，并激活PKC相關通路[17]。宋興福等[18-19]研究發現，肺鱗癌和腺癌細胞質和細胞膜中PKC表達量都有顯著增高，而細胞膜中增加的幅度更明顯，說明肺鱗癌和腺癌與細胞膜PKC-α表達量的增加密切相關。本研究結果表明，黃芪甲苷可以通過抑制細胞膜PKC-α表達量的增加，抑制ActD誘導的肝癌細胞凋亡，為肝癌的治療和預防提供了新的思路和實驗室依據。但黃芪甲苷在其他腫瘤中的作用和作用機制有待于進一步的深入研究。