大豆11S/7S球蛋白比值QTL定位及相關基因分析

武小霞，崔一凡，謝建國，趙雅彬，李佳鵬，井紅鈺，趙 瑩

（東北農業大學農學院，哈爾濱 150030）

大豆（Glycine maxL.Merr.）是世界重要糧油作物，也是人類攝入植物蛋白質主要來源。貯藏、結構和防御相關的三類蛋白是大豆中蛋白存在主要形式，其中貯藏類蛋白在大豆蛋白中約占70%[1]。按照蛋白質沉降系數為分類標準，可將大豆中蛋白質分為4個組分，即2S、7S、11S和15S組分，其中7S與11S球蛋白含量最豐富[2]。7S與11S球蛋白在加工特性與營養品質方面具有顯著差異，因此，兩者也共同決定大豆蛋白制品功能特性以及營養價值[3]。種子中7S和11S球蛋白含量差異影響大豆營養品質及加工特性。

7S球蛋白由多種蛋白共同組成，其最主要成分為β-伴大豆球蛋白，另外還包括堿性7S球蛋白以及γ-伴大豆球蛋白，由α'、α和β亞基組成[4]。7S球蛋白可用于降低肥胖癥患者內臟脂肪及血脂血糖[5]。11S球蛋白主要由酸性亞基A和堿性亞基B組成，其中酸性亞基有增強胰島素功能[6]。11S球蛋白含硫氨基酸含量較高，是7S球蛋白含硫氨基酸含量5～6倍[7]。Kita等發現11S球蛋白中氨基酸含量顯著高于7S球蛋白[8]。這與Coates等發現β-伴大豆球蛋白β-亞基無含硫氨基酸顯著降低，導致7S球蛋白中氨基酸含量降低一致[9]。

QTL定位利用分子標記與基因連鎖關系控制數量性狀基因，是挖掘功能基因主要方法，目前關于大豆11S/7S球蛋白研究多為利用種質資源群體分析11S/7S球蛋白比值對大豆加工特性的影響。與QTL定位相關大豆蛋白研究大部分基于蛋白質含量。目前國內外已開展大量有關大豆蛋白含量及組分QTL定位研究[10-11]，對于蛋白中11S/7S球蛋白比值相關QTL定位及相關基因分析研究較少。本研究以野生大豆ZYD00006為供體，以栽培大豆綏農14為輪回親本構建全基因組導入系，對大豆11S/7S球蛋白比值作QTL定位并分析候選基因，為大豆分子輔助育種提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 植物材料與種植方法

本研究將野生大豆ZYD00006作為供體親本，經雜交與回交導入輪回親本栽培大豆綏農14中，構建一個野生大豆全基因組導入系群體。于2018年及2019年將該群體種植于黑龍江省哈爾濱市香坊區東北農業大學實驗實習與示范向陽基地（北緯45°450 N，東經126°380 E）。每行80株，行長與株距分別為5 m和0.06 m，按區收獲并脫粒，籽粒留作后期分析使用。

1.2 11S/7S球蛋白比值測量

2018年、2019年導入系植株各181份材料，每份材料隨機取100粒磨成豆粉，稱量0.1 g，加入1 mL提取緩沖液（10%NaCL溶液）65℃水浴40 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，與Loading Buffer 2∶1混合備用。參考姜振峰等方法[12]。采用濃度10%分離膠和5%濃縮膠測定7S與11S球蛋白各亞基含量。SDS-PAGE電泳后，置于考馬斯亮藍G-250中染色2 h，反復脫色至膠條上條帶清晰可見。凝膠脫色后掃描儀掃描，用Quantity one（4.6.2）分析凝膠照片，計算11S/7S球蛋白比值。

1.3 統計與分析

利用SPSS 17.0軟件對兩年內大豆11S/7S球蛋白比值作統計分析。所用分子標記信息參照文獻[13]，QTL分析采用ICIMapping 4.1中“CSL”模塊，采用完備區間作圖法和單標記分析法檢測QTL。若似然函數比值對數值（Logarithm of odds，LOD）≥2則認為QTL存在，QTL最終命名采用q+性狀名稱+LG或LG編號+“-”+QTL編號方式[14]。

1.4 基因注釋

將目標區間內基因比對到GO數據庫（https://www.ebi.ac.uk/QuickGO/）與KEGG數據庫（https://www.KEGG.jp/）作基因注釋。采用信息學分析方法，將同源基因信息、顯著富集的代謝通路信息、編碼蛋白信息整合，預測區間內候選基因功能，初步篩選與11S/7S球蛋白比值性狀相關候選基因。

1.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

以輪回親本綏農14為對照，以90%分位數和10%分位數分別作為篩選高低表型極端材料閾值，低于10%分位數11S/7S球蛋白比值材料作為低表型極端備選材料，高于90%分位數11S/7S球蛋白比值材料作為高表型極端備選材料，將兩年得到各極端備選材料取交集得到實時定量材料。

Trizol法提取種子RNA，反轉錄試劑盒（Vazyme）反轉錄成cDNA。為確定候選基因在不同材料中轉錄水平，使用LightCycler480系統和Primer 5軟件設計引物作qRT-PCR分析。通過Primer 5軟件設計6個候選基因特異性引物，內參基因為GmActin4（GenBank No：AF049106），引物序列見表1。退火溫度范圍為55.8～59.1℃，試驗溫度為57℃。候選基因轉錄水平根據2-ΔΔct計算。為保證試驗準確性和可靠性，每個樣品3次重復。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers of qRT-PCR

2 結果與分析

2.1 CSSL群體兩年表型數據分析

2018以及2019年CSSL群體11S/7S球蛋白比值表型數據統計情況見表2。兩年間CSSL群體11S/7S球蛋白比值差異較大，范圍為0.22～5.90。2018年群體11S/7S球蛋白比值平均值為1.52，標準差為0.66，峰度為1.72，偏度為1.33。2019年群體11S/7S球蛋白比值平均值為2.23，標準差為1.23，峰度為0.19，偏度為0.85。CSSL群體底莢高度呈近似正態分布，適用于QTL定位（見圖1）。

2.2 大豆11S/7S球蛋白比值性狀QTL分析

利用單標記分析，在J連鎖群上定位到1個QTL，該位點位于16號染色體上，起始位置為1 046 637 bp，終止于1 170 661 bp，全長124 024 bp，命名為q11S/7S-J-16。加性效應為0.3299，表型貢獻率為6.49%。

利用完備區間作圖法，在3個連鎖群上發現3個大豆11S/7S球蛋白QTL（見表3）。其中，在J連鎖群上定位到QTL與單標記分析檢測到QTL位置相同（見圖2）。

表2 兩年CSSL群體11S/7S球蛋白比值表型數據參數Table 2 Phenotypic data parameters of 11S/7S globulin ratio of CSSL population in two years

圖1 CSSL群體11S/7S球蛋白比值表型數據頻率分布Fig.1 Frequency distribution of phenotypic data of 11S/7S globulin ratio in CSSL population

表3 ICIM法對大豆11S/7S球蛋白比值相關QTL分析Table 3 Analysis of QTL related to soybean 11S/7S globulin ratio by ICIM

圖2 CSSL群體11S/7S球蛋白比值QTL在連鎖群上分布Fig.2 Distribution of QTLs for 11S/7S globulin ratio in CSSL population on linkage group

由表3可知，所有QTL表型貢獻率最大值為6.10%，最小值為4.93%，LOD在2.00～2.49內浮動。通過2018年數據檢測到一個QTL位點q11S/7S-K-1，表型貢獻率為4.93%，加性效應為0.4016。2018年數據檢測到一個QTL位點q11S/7SO-1，該位點表型貢獻率最大為6.10%，加性效應為0.3222。2019年檢測到q11S/7S-J-1表型貢獻率為5.08%，加性效應為0.9879。所有加性效應均為正值，說明控制大豆11S/7S球蛋白有利基因來自于綏農14。

2.3 QTL區間基因注釋

對QTL區間作基因注釋，共得到46個候選基因（見表4）。參考Phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#）網站基因時空表達量數據，結合基因注釋信息分析方法，篩選出與蛋白性狀相關候選基因6個。其中，Glyma.09G014400被描述為功能性抑制劑、脂質轉移蛋白、種子存儲2S蛋白白蛋白超家族蛋白，疏水種子蛋白。Glyma.09G014700被描述為ADP-核糖基化因子GTP酶激活蛋白AGD11相關，Ca2+依賴性磷脂結合蛋白。Glyma.09G015100被描述為磷脂酰肌醇轉移蛋白SEC14和相關蛋白。Glyma.16G034700被注釋為與任何蛋白質或蛋白質復合物。Glyma.16G036200被注釋為60S核糖體蛋白L7，大亞基核糖體蛋白L7e。Glyma.16G036300被注釋為陽離子相關的陽離子氨基酸轉運蛋白，氨基酸轉運蛋白。

2.4 候選基因表達模式分析

上述6個基因在2個高表型、2個低表型及對照中相對表達量如圖3所示。

由圖3可知，Glyma.09G015100在低表型及高表型材料中相對表達量均高于對照材料，說明該基因在球蛋白表達中有促進作用，還可看出，在高表型材料R31/R190中相對表達量顯著高于低表型材料R33/R153，初步說明，該基因對11S蛋白正調控。其余5個基因，在低表型及高表型材料中相對表達量均低于對照，對球蛋白負調控。認為Glyma.09G015100更具有研究價值，可在今后深入研究其功能。

表4 候選基因功能注釋Table 4 Function annotation of the candidate genes

圖3 候選基因在不同表性材料中相對表達量Fig.3 Relative expression levels of candidate genes in different surface materials

3 討論與結論

研究表明，11S球蛋白對營養品質及加工特性影響優于7S球蛋白。11S球蛋白含量上升同時導致7S球蛋白含量下降，因此，可通過適當調整11S/7S球蛋白比值，實現大豆營養品質與加工特性改良。11S球蛋白含量有利于提高豆腐質構特性，與豆腐質構指標之間均呈正相關。Poysa等研究發現11S球蛋白中A3亞基對豆腐品質影響最大，A4亞基則對豆腐品質有負影響[15]。Nishinari等認為缺失11SA 5'端球蛋白大豆制成的豆腐品質更好[16]。Fukushima認為11S球蛋白中亞基與大豆蛋白凝膠速度和透明性密切相關[17]。Saio等認為11S球蛋白加熱后形成的凝膠富有保水性，有較高拉應力及剪切力，在制成豆腐時凝膠硬度、彈性較好[18]。Kitamura等分析1 700份大豆種子蛋白亞基含量得出，一般大豆11S/7S比值為1.12[19]。劉香英等利用聚丙烯酰胺凝膠分析黑吉遼內蒙古四省163個大豆品種，發現11S/7S比值為1.3～3.32，平均值為1.97[20]。劉順湖等鑒定我國138份野生豆、409份地方品種以及國內148份育成品種發現，11S/7S比值平均分別為1.4、2.0和2.7[21]。姜振峰等采用線性梯度SDS-PAGE法鑒定442份黑龍江省內大豆資源，結果表明11S/7S比值為0.93～2.77，平均值為1.7[22]。

關于大豆蛋白QTL定位研究較多，CSSL可用作QTL分析重要材料，因其在基因組中僅包含較少供體親本片段，且遺傳背景高度一致。鑒于這種材料的優越性，近年來已在水稻[23]、玉米[24]、大豆等農作物中廣泛使用。野生和半野生資源包含稀有基因，具有抗逆性、抗病性和抗蟲性。本研究以野生大豆ZYD00006為供體親本，以栽培大豆SN14為輪回親本構建CSSL群體。經多代回交后代，后代CSSL個體僅包含較少導入野生資源。大多數遺傳背景恢復到SN14。野生資源特有優良基因被保留在個體中，不良特性被去除。通常，CSSL種群可作為創新資源直接或間接用于育種研究。將擬南芥同源基因功能信息（https://www.arabidopsis.org）與基因注釋信息相結合，共同分析并篩選與11S/7S球蛋白比值性狀相關候選基因。通過qRT-PCR分析，Glyma.09G015100可能是影響大豆11S/7S球蛋白比值的功能基因。Glyma.09G015100屬于磷脂酰肌醇轉移蛋白（sec14p）家族[24]，該家族主要定位在高爾基體中，高爾基體是蛋白質主要合成加工運輸場所，參與來自高爾基體中各復合產物蛋白運輸，可能影響大豆球蛋白中各亞基形成，進而影響7S/11S球蛋白比值，故將Glyma.09G015100作為影響大豆11S/7S球蛋白比值候選基因。本研究將為大豆11S/7S球蛋白比值分子標記輔助育種及相關基因克隆提供理論指導。