奶牛胎盤還原性多肽不同蛋白酶酶解方法建立與優化

沈留紅，張 鉞，尤留超，朱潁琨，石 湉，董 可，曹隨忠*

（1.四川農業大學動物醫學院，成都 611130；2.成都市動物疫病預防控制中心，成都 610041；3.四川育強本草生物技術有限公司，成都 611130）

胎盤組織含有多肽、激素、免疫球蛋白、環肽、甾體和氨基酸等生物活性成分[1-2]，具有抗氧化、抗疲勞和促免疫等作用[3-4]。中醫將其蒸煮干燥并碾碎入藥，近年來學者通過改變蒸煮條件和優化炮制工藝等方式有效提高胎盤制品生物學活性和總物質含量[5]，但難以獲取成分種類單一胎盤制劑。因此，胎盤多肽成為目前胎盤活性成分研究熱點之一。研究表明，多種動物胎盤均具有以酶解法制備生物活性多肽潛力[6]，可獲取成分種類單一、作用方式確定胎盤多肽，提高胎盤制劑生物安全性[7-8]。目前，酶解胎盤制備活性多肽研究主要集中在活性提升，但最高活性酶解條件提取率低[9]，應結合酶解產物活性和提取率綜合優化。奶牛胎盤作為分娩副產物，來源廣泛，含有多種天然活性多肽[10]，目前尚未見酶解制備多肽及其提取率優化研究。本研究通過木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解奶牛胎盤制備還原性多肽，分析各因素對其還原性多肽提取率和還原力的影響，探究最佳提取條件，并以每克胎盤提取多肽的還原力作為綜合提取率，進一步作響應面優化并驗證，以期獲得具有較高還原活性和提取率奶牛胎盤多肽，為其臨床開發應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

采集規?；膛鲎匀环置涿撀浣】抵袊伤固鼓膛Ｐ迈r胎盤若干，立即使用生理鹽水清洗，除去胎盤內殘留血液及污物，至胎盤子葉呈粉紅色，于-20℃冰柜保存。

1.2 試驗試劑和儀器

1.2.1 試驗儀器

Varioskan LUX全波長多功能酶標儀、HH-4數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器）、LYOQUEST冷凍干燥機（阿自倍爾泰事達）、Sorvall?Legend?XT冷凍離心機、Barnstead?GenPure?Pro超純水機（賽默飛）。

1.2.2 試驗試劑

胃蛋白酶（250 U·mg-1，批號810H021），木瓜蛋白酶（800 U·mg-1，批號621G025），索萊寶生物；磷 酸 二 氫 鉀（KH2PO4）、磷 酸 二 氫 鈉（NaH2PO4）、三氯乙酸（CCl3COOH）、三氯化鐵（FeCl3），鐵氰化鉀（K3[Fe(CN)6]）、維生素C（Vitamin C，VitC），均為分析純，成都科隆。

1.3 方法

1.3.1 奶牛胎盤組織預處理

將奶牛胎盤組織切割稱量后置于密閉燒杯，37℃水浴復溫融化，剪刀初步剪碎，保證其原有分子不因組織勻漿機產熱而分解，冰浴下使用組織勻漿機以12 000 r·min-1破碎至無明顯組織碎塊。

1.3.2 蛋白酶酶解法制備奶牛胎盤多肽

嚴格按照說明書所述最適條件（木瓜蛋白酶和胃蛋白酶最適溫度分別為55和37℃，最適pH分別為6.5和2.5），以1.3.1制備胎盤勻漿作為底物酶解后，沸水浴10 min滅活。將酶解液以6 000 r·min-1離心5 min，收集上清，冷凍干燥24 h，稱量凍干粉質量并計算凍干粉質量所占胎盤組織勻漿質量百分比，記為提取率R。以Design Expert 8.0.6軟件基于Box-Behenken中心響應法設計響應面試驗，選擇酶解時間、底物濃度、酶底比3因素為自變量，做3因素3水平共17個試驗點，包括5個中心點和12個析因點。參考文獻[11-12]設計各因素水平，分別記酶解時間（h）、底物濃度（%）和酶底比（%）為因素A、B和C，酶解時間3、5、7 h；底物濃度為10%、30%、50%；酶底比為1%、3%、5%，分別對應A、B、C因素水平為-1、0、1。

1.3.3 普魯士藍法標準曲線建立和奶牛胎盤多肽還原能力測定

使用普魯士藍法測定樣品還原力，具有還原能力樣品可將鐵氰化鉀還原成亞鐵氰化鉀（K4Fe(CN)6·3H2O），再以Fe3+形成普魯士藍（Fe4[Fe(CN)6]3），由700 nm處吸光度（A700）變化檢測還原力。使用不同濃度VitC溶液建立標準曲線，評估樣品還原能力。分別將VitC配制成100.00、50.00、25.00、12.50、6.25和3.125μg·mL-1標準溶液；另配制10% CCl3COOH、10% K3[Fe(CN)6]、0.1% FeCl3和pH 6.6磷酸鹽緩沖液。向75μL各濃度VitC標準溶液先后加入75μL pH 6.6磷酸緩沖液和1% K3[Fe(CN)6]溶液，充分震蕩后50℃水浴20 min，加入10%CCl3COOH 75μL，3 000 r·min-1離心1 min，制得待測液。取200μL待測液于96孔板中，加入0.1%FeCl320μL，測定其A700。以標準溶液VitC濃度為橫坐標，A700為縱坐標，使用SPSS 24.0以線性回歸方式建立標準曲線。將各組制得胎盤多肽凍干粉使用pH 6.6磷酸鹽緩沖液稀釋為1 mg·mL-1樣液，按照上述方法，測定其A700，將其代入標準曲線以獲得樣品相當VitC溶液濃度，記為VitC當量（μg·mg-1）。

1.4 數據分析與處理

分別以提取率和還原力為響應值，應用Design expert 8.0.6分析，以酶解時間、底物濃度、酶底比對其提取率和還原力影響建立響應面回歸模型，并驗證其擬合度和可靠性。

1.5 奶牛胎盤多肽高效提取方法建立和優化

基于響應面模型，分別以最大化提取率和VitC當量優化各提取因素。依照1.4所確定最優化條件作6次平行試驗驗證響應面模型有效性，對比實際提取率和還原力與響應面預期值。將提取率和還原力作相關性分析，以每克胎盤所提取多肽還原力作為綜合提取率E（μg·g-1）。以其為響應值，建立響應面回歸模型分析擬合度和可靠性后，以該模型優化奶牛胎盤多肽提取條件，并作6次試驗，對比實際綜合提取率與響應面預期值。

2 結果與分析

2.1 普魯士藍法標準曲線建立

以100、50、25、12.5、6.25和3.125μg·mL-1VitC標準溶液使用普魯士藍法測得A700為1.67、0.802、0.367、0.187、0.15和0.097，以VitC濃度為自變量，A700為因變量，建立截距為0.008（SE=0.0025），自變量因數為0.0164（SE=0.001）線性回歸模型為A700=0.0164VitC當量+0.008，相關系數R2為99.6%，預測效果可靠，標準曲線見圖1。

圖1 維生素C的普魯士藍法標準曲線Fig.1 Prussian blue standard curve for VitC

2.2 木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解法制備奶牛胎盤還原性多肽

木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解法制備奶牛胎盤還原性多肽響應面試驗結果如表1所示。A、B和C三因素對提取率和VitC當量存在復雜的相互作用關系。

2.3 不同酶解條件對奶牛胎盤多肽提取率和還原力的影響

分別以提取率和還原力為響應值，由表1得到響應面二次回歸方程分別為：木瓜蛋白酶R=6.35+0.59A+0.55B+0.66C-0.15AB+0.55AC-0.25BC-0.51A2-0.61B2-0.27C2；VitC當量=67.42-7.97A-1.09B+5.02C-1.67AB-5.27AC-1.74BC-8.54A2-0.96B2-13.29C2。

胃蛋白酶R=5.83+0.97A+0.29B+0.18C-0.4AB-0.083AC+0.085BC-1.03A2-0.28B2-0.19C2；VitC當量=56.52-3.81A+6.87B+6.37C-0.54AB+10.12AC-2.09BC-6.4A2-10.86B2-8.58C2。

木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解奶牛胎盤制備還原性多肽響應面試驗結果如表2所示。

表1 木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解奶牛胎盤制備還原性多肽響應面試驗結果Table 1 Response surface results of papain and pepsin hydrolysis of cow's placenta to prepare reducing polypeptide

表2 木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解奶牛胎盤制備還原性多肽的回歸模型方差分析結果Table 2 Regression model analysis of papain and pepsin hydrolyzed placenta preparing reducing polypeptides

由表2可知，木瓜蛋白酶和胃蛋白酶回歸模型均極顯著（P＜0.01），失擬項均不顯著（P＞0.05），木瓜蛋白酶和胃蛋白酶模型R2分別為96.56%、99.22%和97.54%、97.73%，校正系數R2分別為92.14%、98.21%和94.38%、94.82%，模型擬合度較好；木瓜蛋白酶在提取率模型中，一次項A、B、C和二次項A2、B2均與提取率呈極顯著相關（P＜0.01）。對提取率影響因素C＞A＞B；還原力模型中，一次項A、C，二次項A2、C2，交互項AC均與響應值極顯著相關（P＜0.01），表明各因素間存在相互影響。對還原力因素A＞C＞B；胃蛋白酶提取率模型中，一次項A、B，二次項A2和交互項AB對提取率影響極顯著（P＜0.01），交互項AB對提取率影響顯著（P＜0.05），還原力模型中一次項A、B、C，二次項A2、B2、C2與交互項AC對還原力影響極顯著（P＜0.01），表明各因素對提取率影響并非線性關系，存在一定相互作用。提取率影響因素A＞B＞C；對還原力影響因素B＞C＞A。

由圖2可見，固定酶底比，提取率隨反應時間而上升，但隨酶解時間延長，其響應值上升速率逐漸減慢，表示試驗水平內底物可完全酶解（見圖2a），還原力隨酶解時間先上升后下降（見圖2d）；固定酶解時間，提取率隨底物濃度、酶底比提高而上升，反應時間和酶底比對提取率存在正向相互作用（見圖2b、2c），還原力隨酶底比先升后降（見圖2e）；固定底物濃度，還原力隨酶底比提高而上升，且酶底比越高，酶解時間越短，響應值越高（見圖2f）。

圖2 各因素交互作用對木瓜蛋白酶酶解奶牛胎盤提取率和還原力的影響Fig.2 Effect of interaction of various factors on the yield and antioxidant activity of papain enzymatically hydrolyzed cows'placenta

固定酶底比，底物濃度對提取率影響?。ㄒ妶D3a），酶解時間對還原力影響小，而隨底物濃度上升，相同時間下的還原力升高（見圖3d）。固定反應時間，提取率隨酶底比先升后降，表明最佳酶底比存在于試驗設計范圍內（見圖3b），酶底比越高，則還原力越高，同時底物濃度與酶底比呈正向相互作用（見圖3e）；固定底物濃度，提取率隨酶底比提高而上升，且酶底比越高，酶解時間越短，響應值越高（見圖3c），可見，反應時間短時，酶底比越高，還原力越低，反應時間長時，酶底比越高，還原力越高（見圖3f）。

以最大化提取率和Vitc當量為目標通過Design Expert 8.0.6軟件分析，木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解奶牛胎盤理論最佳條件分別為：反應時間6.18、6.22 h，底物濃度34.78%、30.71%，酶底比5.00%、3.18%，此時理論提取率為6.97%、6.14%，反應時間3.95、4.83h，底物濃度22.04%、35.82%，酶底比3.64%、3.57%，此時理論Vitc當量為70.54、58.59μg·mg-1。根據優化結果作6次平行試驗驗證響應面模型有效性，實際驗證試驗條件為：反應時間6.18、6.30 h，底物濃度35%、30%，酶底比5.0%、3.0%和反應時間4.0、4.8 h，底物濃度22%、36%，酶底比3.5%、3.5%，實測平均提取率分別為6.80%、6.05%，VitC當量分別為68.72、57.96μg·mg-1，均與理論值接近且重復性較好，說明響應面優化結果可靠。

圖3 各因素交互作用對奶牛胎盤胃蛋白酶酶解物提取率和還原力的影響Fig.3 Effect of interaction of various factors on the yield and antioxidant activity of pepsin hydrolysate in dairy cow placenta

2.4 木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解奶牛胎盤制備還原性多肽方法的優化

使用Pearson相關性檢驗法對上述各結果分析顯示，不同方式提取率與還原力間存在不同相互關系，與木瓜蛋白酶和胃蛋白酶相關性系數分別為0.176（P=0.5）、0.248（P=0.337），即提取率與VitC當量均無明顯相關性（P＞0.05）?？梢?，酶解條件對胎盤多肽還原力影響較大，為同時獲取較高提取率與還原力，綜合這兩指標建立綜合提取率E（μg·g-1），以各因素水平和E值為響應值，進一步優化酶解條件。

以綜合提取率對木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解奶牛胎盤制備還原性多肽響應面分析結果如表3所示。

表3 木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解奶牛胎盤制備還原性多肽的優化Table 3 Optimization of papain and pepsin enzymatic hydrolysis of fetal placenta to prepare antioxidant active peptide

2.5 以綜合提取率為響應值的木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解奶牛胎盤制備還原性多肽的優化

基于木瓜蛋白酶和胃蛋白酶制備胎盤還原性多肽響應值建立響應面回歸模型，得二次響應面回歸方程分別為：E=4284.35-138.73A+228.94B+79.69C-149.21AB-294.33AC-197.49BC-880.4A2-459.82B2-881.19C2和E=3297.34+207.81A+448.33B+447.25C-118.46AB+500.10AC-57.20BC-825.994A2-685.81B2-598.59C2。

如表4所示，木瓜蛋白酶和胃蛋白酶響應面模型均極顯著（P＜0.01）、失擬項均不顯著（P＞0.05），模型R2分別為97.66%和97.99%，校正系數R2為94.65%和95.40%，模型描述性均較好。木瓜蛋白酶一次項C、二次項A2、B2、C2均極顯著影響響應值（P＜0.01），一次項B、交互項AC顯著影響響應值（P＜0.05）。而胃蛋白酶一次項B、C，二次項A2、B2、C2與交互項AC均極顯著影響響應值（P＜0.01），一次項A對顯著影響響應值（P＜0.05）?？梢姼饕蛩亻g存在相互作用。由F值可見，對響應值影響木瓜蛋白酶：C因素＞B因素＞C因素，胃蛋白酶：B因素＞C因素＞A因素。

表4 以綜合提取率為響應值的木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解胎盤試驗回歸模型方差分析結果Table 4 Results of variance analysis of papain-enzymed placenta test regression model with comprehensive extraction rate response

固定酶底比，響應值隨酶解時間先升后降，且底物濃度越高，響應值越高，但隨酶解時間推移，底物濃度導致的響應值差異逐漸減少（見圖4a）；固定酶解時間，響應值隨酶底比升高而升高，且在酶底比較高時，底物濃度對響應值影響差異減?。ㄒ妶D4b）；固定底物濃度，酶底比與酶解時間提高均使響應值先升后降，且酶底比越高，達到最高響應值時間短，響應值隨后下降越快（見圖4c）。固定酶底比，響應值隨酶解時間先升后降，且底物濃度越高，同一時間響應值越高，但底物濃度對響應值變化趨勢無明顯影響（見圖5a）；固定酶解時間，響應值隨底物濃度先升后降，且酶底比越高，在相同底物濃度時響應值越高（見圖5b）；固定底物濃度，酶解時間短時，響應值隨酶底比升高先升后降，而酶解時間長時，響應值隨酶底比升高而升高（見圖5c）。

圖4 各因素交互作用對奶牛胎盤木瓜蛋白酶提取物綜合提取率的影響Fig.4 Effect of interaction of various factors on the comprehensive extraction rate of papain extract from dairy cow placenta

圖5 各因素交互作用對奶牛胎盤胃蛋白酶提取物綜合提取率的影響Fig.5 Effect of interaction of various factors on the comprehensive extraction rate of pepsin extract from dairy cow placenta

以最大化綜合提取率為目標通過Design Expert 8.0.6軟件分析，木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解奶牛胎盤理論最佳條件為：反應時間4.70、5.49 h，底物濃度34.03%、35.74%，酶底比3.66%、3.92%，此時理論綜合提取率為4 414.09、3 490.41μg·g-1。根據優化結果作6次平行試驗驗證響應面模型有效性，實際驗證試驗條件為：反應時間4.5、5.5 h，底物濃度34%、56%，酶底比3.6%、4.0%，實測平均綜合提取率為4 397.32和3 466.32μg·g-1，與理論值接近且重復性較好，說明響應面優化結果可靠。

3 討論與結論

3.1 不同木瓜蛋白酶酶解條件對奶牛胎盤還原性多肽制備的影響

木瓜蛋白酶由番木瓜（Carica papaya）果皮中提取，廣泛用于食品工業生產和性質改良（如肉質嫩化、短肽提取和啤酒工業等）[13]，還可酶解動植物組織以獲取具有抗氧化、降血壓和促進免疫等生物學活性多肽[14-15]。本試驗嚴格按說明書最佳pH

6.5作酶解反應，但基于底物物化性質，在酶解過程中反應體系最佳起始pH出現差異[16]，制備植物源性多肽時，最佳起始酶解pH常偏酸性[17]，而酶解動物組織效果最佳pH常為中性或堿性[16]，推測其較為廣泛酶切能力使反應體系中非蛋白成分參與水解，造成pH變化，這可能是本試驗所制備胎盤多肽還原力受酶底比、酶解時間及其相互作用影響均顯著的原因。本試驗建立提取率最高條件為反應時間6.18 h，底物濃度34.78%，酶底比5.00%，此時理論提取率為6.97%，優于王君旸對羊胎盤的提取率[18]；還原力最高條件為反應時間3.95 h，底物濃度22.04%，酶底比3.64%，此時理論VitC當量為70.54μg·mg-1，優于師玉淼等提取豬胎盤多肽還原力[19]；同時理論提取率和VitC當量均優于超聲破碎和胰蛋白酶酶解法提取結果[20]；此外，最高提取率和還原力所需酶解條件差異較大，且相同條件下胎盤多肽提取率與還原活性無顯著相關性，與向澤敏等結果一致[9]，表明蛋白酶對組織蛋白酶解是一個動態過程，具有生物活性的多肽若仍具有蛋白酶酶切位點則被進一步酶解，使其失去原有活性[21]。

3.2 不同胃蛋白酶酶解條件對奶牛胎盤組織還原性多肽制備的影響

胃蛋白酶是機體重要消化酶，常被用于模擬胃內消化環境和提取多種生物源性多肽。因最適pH較極端，常導致蛋白質變性，暴露內部基團，獲得較高酶解產物提取率[22]，還可將無生物活性組織蛋白酶解成具有一定生物活性肽段，包括抗氧化多肽[23-24]。本試驗反應時間6.22 h，底物濃度30.71%，酶底比3.18%時獲得最高理論提取率6.14%；反應時間4.83 h，底物濃度35.82%，酶底比3.57%時獲得最高理論VitC當量58.59μg·mg-1，提取率和最高VitC當量均優于超聲破碎和胰蛋白酶，與師玉淼等[19]結果一致，表明不同動物胎盤均能被胃蛋白酶酶解為具有抗氧化能力的多肽；同時，本試驗酶底比對提取率影響不顯著，而底物濃度影響顯著，可能因胃蛋白酶對奶牛胎盤蛋白酶解過程中米氏常數較高[25]，使底物濃度限制酶解速度，高底物濃度可明顯提升反應速率，相同時間內產生可溶性多肽增加。此外，奶牛胎盤多肽抗氧化能力受各種因素影響均極顯著，且與提取率無顯著相關，說明奶牛胎盤酶解是多底物酶解反應，由于對不同底物親和力不同，底物濃度變化顯著影響酶解進程[26]，本試驗中表現為固定酶底比下，底物濃度越高，相同酶解時間下產生的抗氧化多肽濃度越高，抗氧化能力隨酶解時間延長先升后降；而隨酶底比提升，酶解體系中抗氧化多肽含量達到峰值所需時間越短，抗氧化能力下降也隨之加快。

3.3 不同酶解條件對奶牛胎盤還原性多肽綜合提取率的影響

蛋白酶解產物活性受溫度、pH、底物濃度、酶底比和酶解時間等眾多因素影響，規律復雜，為獲取較高活性和提取率多肽，需優化酶解條件。本研究結果表明，木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解奶牛胎盤制備抗還原性多肽最優條件為反應時間4.7 h，底物濃度34.03%，酶底比3.66%和反應時間5.49 h，底物濃度35.74%，酶底比3.92%，綜合提取率分別為4 414.09和3 490.41μg·g-1，此時胎盤多肽提取率和還原力仍高于或接近師玉淼和王君旸等提取結果[8,18]。以綜合提取率作為響應值優化可較好平衡各因素對提取率和還原性的影響，在保證提取率前提下獲得較高活性奶牛胎盤多肽。高底物濃度在固定酶底比下降低酶解產物對胎盤蛋白競爭性抑制作用，產生更多活性多肽，從而提高相同酶解時間內綜合提取率[9,29]；酶解時間固定時，酶底比對底物濃度與響應值相關性影響較大，證明較高酶底比可加快酶解反應速率，進一步酶解還原性多肽，降低還原力[28]；底物濃度固定，酶解時間短時，綜合提取率隨酶底比降低，但隨酶解時間延長，低酶底下綜合提取率上升，而高酶底比下則先升后降，說明酶底比在一定程度上決定同一時間下的酶解速率，決定提取率與還原能力，影響綜合提取率[21]。