ARID4B在?；撬嵴{節成肌細胞C2C12蛋白質合成中的作用

高學軍，王璐璐，祁 昊，王 哲，甄 貞

（東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

畜禽蛋白質產量由骨骼肌總量決定。骨骼肌由軸旁中胚層發育而來，由干細胞定向分化形成單核成肌細胞，進而融合形成多核肌管和成熟肌纖維。骨骼肌細胞生長發育過程不僅包括成肌細胞增殖與分化，也與蛋白質合成水平有關[1]。成肌細胞蛋白質合成是骨骼肌生長發育重要過程之一。

蛋白質生物合成受多種信號通路調控。絲/蘇氨酸蛋白激酶mTOR（The mechanistic target of rapamycin）在細胞生長、增殖和凋亡等過程中發揮重要生物學作用，是眾多代謝過程中核心調控因子。研究發現，mTOR信號通路可促進骨骼肌生長及再生[2]。mTOR通過mTOR復合物1（mTOR complex 1，mTORC1）和mTOR復合物2（mTOR complex 2，mTORC2）發揮調節細胞生長和蛋白質合成作用[3-4]。mTORC1使其下游兩個重要信號分子S6K1（Ribosomal protein S6 kinase 1）與4EBP1（4E-binding protein 1）發生磷酸化，4EBP1磷酸化后翻譯起始因子eIF4E（Eukaryotic initiation factor 4E）被釋放；eIF4E與eIF4G（Eukaryotic initiation factor 4G）結合，提高mRNA穩定性，促進mRNA翻譯起始；而S6K1磷酸化促使核糖體蛋白S6磷酸化，增加與蛋白質合成相關編碼蛋白mRNA翻譯過程。mTOR通過下游信號分子作用，促進細胞生長和蛋白質合成[5]。mTORC2則通過調節AKT和PKC激酶活化，參與細胞骨架構建及細胞極性調節等過程，影響細胞增殖[5]。

各種營養素（氨基酸、脂肪酸、葡萄糖等）和胰島素、生長激素等均可通過PI3K（Phosphatidylinositol 3-kinase）/Akt（Protein kinese B）信號通路mTOR途徑調節成肌細胞蛋白質合成[6]。在營養因子中，氨基酸既是蛋白質合成必需底物，也是mTORC1活性調節必要信號分子[7]。牛磺酸（Taurine，Tau）是哺乳動物組織中β-氨基磺酸，以游離形式存在或與膽汁酸形成復合物[8]。細胞通過Na+依賴性?；撬徂D運蛋白（Tau transporter，TauT）積累?；撬?。此外，Tau也可通過Na+非依賴性β-氨基酸轉運蛋白（The proton-coupled amino acid transporter，PAT1）進入細胞。Naghavi等研究表明，Tau可調 節PI3K/AKT、AKT/FOXO1、JAK2/STAT3和mTOR/AMPK等信號通路[9]。

AT富集區域家族（Adenine thymine-rich interactive domain family，ARID家族）是一類結合富含AT序列DNA的轉錄因子，具有多種調控作用[10]。ARID家族可分為7個亞家族，分別為ARID1、ARID2、ARID3、ARID4、ARID5、JARID1、JARID2[9]。ARID家族與調控細胞生長、分化和發育過程中基因表達及染色質重塑有關。ARID4B是ARID家族成員，一種染色質重塑因子[9]。ARID4B參與細胞生長和分化，與腫瘤形成密切相關，ARID4B基因在乳腺癌、肺癌、結腸癌、胰腺癌、卵巢癌和正常睪丸中高度表達，但在其他正常組織中表達有限[11]。ARID4B募集mSIN3A組蛋白脫乙酰酶復合物并誘導乳腺癌細胞轉移[12]。尚未見ARID4B介導Tau調節mTOR等途徑影響蛋白質合成的報道。

本試驗擬觀察ARID4B對小鼠骨骼肌成肌細胞系C2C12細胞總蛋白質合成以及mTOR磷酸化的影響，進一步分析Tau是否通過ARID4B-mTOR信號通路調節C2C12細胞蛋白質合成。研究結果為揭示ARID4B作用機理提供理論依據，也為Tau應用于骨骼肌生長發育和畜禽蛋白質產量提升奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

儀器：CO2細胞培養箱（Thermo，美國），熒光定量PCR儀（Eppendorf，德國），SW-CJ-IFD無菌操作臺（安泰，蘇州），YC-1層析實驗冷柜（亞星儀科，北京），TY-80A/S脫色搖床（榮華儀器，江蘇），倒置相差顯微鏡（DFC280，Leica，德國）。

試劑：?；撬幔兌龋?9%）（Sigma，美國），優質胎牛血清（P30-1402，PAN Bio-tech，德國），DMEM（12800-058，Gibco，美國），蛋白Marker（PR1800，Gibco，美國），OPTI-MEMⅠ（31985070，Gibco，美國），根據ARID4B基因序列設計合成的siRNAoligos、陰性對照siRNA（吉瑪，蘇州），mTOR（#2983）、磷酸化mTOR（p-mTOR）（Ser2448，#5536）（Cell Signaling Technology，美國），ARID4B（24499-1-AP，Proteintech，美國），Anti-Puromycin抗體（MABE343，Millipore，美國），β-actin抗體（sc-47778，Santa Cruz Technology，美國），二辛可寧酸（Bicinchoninic acid，BCA），蛋白濃度測定試劑盒（P0012S，碧云天，北京）。

C2C12細胞：試驗用小鼠成肌細胞系由東北農業大學生命科學學院嚴云勤教授實驗室饋贈。

1.2 細胞培養

將C2C12細胞置于37℃、5%CO2培養箱培養，待培養瓶中細胞生長至鋪滿瓶底70%～80%，DHank's液清洗細胞兩次；吸盡培養瓶中液體后，加入500μL胰蛋白酶將其消化，37℃消化1 min左右，輕輕搖晃細胞瓶，待觀察至細胞大部分脫落，根據試驗所需量，加入含2×雙抗、10% FBS的DMEM/F12培養液，以適當密度接種于細胞培養瓶或細胞培養板中用于后續研究。

1.3 篩選ARID4B干擾片段

ARID4B干擾片段和陰性對照RNA片段（Negative control，NC）由蘇州吉瑪生物有限公司設計并合成。以適當密度細胞懸液均勻鋪在六孔板中，待細胞貼壁后更換成OPTI-MEMⅠ培養液，細胞饑餓12 h后，分為以下4個試驗組：NC組、ARID4B-siRNA-1組、ARID4B-siRNA-2組、ARID4B-siRNA-3組，3條siRNA序列見表1。

表1 ARID4B-siRNAs序列Table 1 Sequences of ARID4B-siRNAs

1.4 細胞瞬時轉染

適當密度細胞懸液均勻鋪于六孔板，待細胞貼壁后，試驗分4組：轉染NC組、Tau處理同時轉染NC組、轉染ARID4B siRNA組、Tau處理同時轉染ARID4B siRNA組。利用siRNA-Mate轉染試劑轉染ARID4B siRNA，DEPC水溶解ARID4B siRNA粉末，至其終濃度20μmol·L-1；將ARID4B siRNA、NC分別與siRNA-Mate混勻（5μL NC/siRNA+8μL siRNA-Mate），靜置復合物15 min，每孔用D-Hank's液清洗兩遍，加入700μL的Opti-MEM I，吹打混勻，將復合物加入六孔板中。37℃、5% CO2培養箱培養24 h收樣用于后續試驗。

1.5 熒光定量PCR

采用qRT-PCR檢測mTORmRNA表達。用RNA easyTM動物RNA抽提試劑盒提取細胞中RNA，紫外分光光度法檢測RNA濃度。RNA純度合格后，用于反轉錄合成cDNA，反轉錄反應體系見表2，37℃處理30 min，85℃保溫5 min。

表2 反轉錄反應體系Table 2 Content of reverse transcription complex

使用qRT-PCR試劑盒（全式金，北京）將反轉錄cDNA產物直接用于后續qRT-PCR。冰上制備反應體系，反應程序：94℃，30 s預變性。94℃，5 s；60℃，30 s；40個循環。使用Primer 5軟件設計qRT-PCR引物，送華大生物科技有限公司（武漢）合成，qRT-PCR所用引物序列見表3。以β-actin為內參基因，采用ΔΔCt法分析，計算相對定量結果（2-ΔΔCt法）。

表3 qRT-PCR所用引物序列Table 3 Primer sequences for qRT-PCR

1.6 SUnSET法測定蛋白質合成速率

Enrico等開發一種基于非放射性熒光激活細胞分選的測定方法，稱為SUnSET（Surface sensing of translation）法[13]。該方法可檢測哺乳動物細胞中蛋白質合成速率。嘌呤霉素（Puromycin）是一種氨基核苷抗生素，與氨基酰tRNA結構接近，可作為蛋白質合成抑制劑。向細胞中添加少量嘌呤霉素，嘌呤霉素可整合至新合成的多肽鏈中阻止肽鏈延長，嘌呤霉素結合蛋白質數量可反映蛋白質合成速率。在無菌條件下用水將嘌呤霉素溶解并過濾，配制為10 mg·mL-1原液，-20℃保存。取生長良好C2C12細胞，以適當密度接種于六孔板。當細胞生長至70%左右，更換成OPTI-MEMⅠ培養液，饑餓12 h，加入不同濃度Tau（0、60、120、160和240μmol·L-1），孵育24 h，在收樣0.5 h前，添加嘌呤霉素，使其終濃度為10μg·mL-1。處理0.5 h后收樣，作Western blot檢測。

1.7 BCA法測定細胞總蛋白質含量

采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測C2C12細胞中總蛋白質含量。將試劑A與B充分混勻（50∶1），配置BCA工作液，室溫靜置24 h。標準曲線制作：完全溶解蛋白標準品，PBS稀釋至終濃度0.5 mg·mL-1；蛋白濃度測定：取標準品稀釋液按0、1、2、4、8、12、16和20μL加到96孔板標準品孔中，將C2C12細胞接種于六孔板，待細胞長至60%～70%，更換成OPTI-MEMⅠ培養液，饑餓12 h，加入不同濃度Tau，孵育24 h，取10μL樣品到96孔板樣品孔中，PBS補足至20μL，各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置30 min，取出平板于酶標儀上測吸光度，測定波長為562 nm。按照標準曲線計算蛋白質含量。

1.8 蛋白提取與蛋白印跡

將收樣細胞去除培養液，PBS沖洗3遍，加入適量2×SDS上樣緩沖液，靜置10 min，充分裂解，細胞刮收集細胞，轉移至1.5 mL EP管，沸水煮10 min，超聲3次，每次15 s，收集樣品用于后續Western blot試驗。

采用Western blot方法檢測mTOR、p-mTOR（Ser2448）、ARID4B和β-actin蛋白水平變化，按照SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒說明書（P0012AC，碧云天），制備分離膠和濃縮膠，點樣。4℃、恒壓80 V電泳；當溴酚藍指示劑約達到分離膠界面時調電壓至120 V，距離膠底1 cm時關閉電源；恒壓75 V轉膜90 min；轉膜結束后，根據目的條帶分子質量剪出所需蛋白條帶；放入含5%脫脂乳TBST溶液中，于37℃搖床封閉1.5 h；將NC膜置于一抗稀釋液，4℃搖床孵育過夜；次日，二抗37℃搖床孵育90 min，曝光，以β-actin為內參。使用Image J軟件掃描蛋白灰度值。

1.9 統計分析

所得數據以平均值±標準差表示。用Excel 17.0軟件處理和分析數據，數據標記字母相同為差異不顯著（P＞0.05），字母不同為差異顯著（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同濃度Tau對C2C12細胞總蛋白質含量和蛋白質合成速率的影響

用不同濃度Tau處理C2C12細胞24 h，采用SUnSET法檢測添加不同濃度Tau細胞中蛋白質合成速率。結果表明，在120μmol·L-1Tau處理下，蛋白質合成速率最高，后逐漸下降（見圖1A和B）。通過BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測C2C12細胞中總蛋白質含量（見圖1C），隨Tau濃度從0增加至120μmol·L-1，總蛋白質含量逐漸增加，并在120μmol·L-1處達到峰值，后下降?？芍琓au劑量依賴性調節C2C12細胞中蛋白質合成速率和總蛋白質含量。

2.2 不同濃度Tau對C2C12細胞蛋白質合成相關信號通路的影響

由圖2可知，添加不同濃度Tau處理細胞12 h后，Western blot檢測p-mTOR、mTOR、ARID4B蛋白表達水平變化，結果表明，添加低濃度（＜120 μmol·L-1）Tau可增加C2C12中磷酸化mTOR和ARID4B蛋白表達水平；添加高濃度（＞120μmol·L-1）Tau，磷酸化mTOR和ARID4B蛋白表達水平逐漸降低，120μmol·L-1處呈現峰值。以上試驗數據表明Tau劑量依賴性促進C2C12細胞蛋白質合成。

圖1 Tau對C2C12細胞總蛋白質含量和蛋白質合成速率的影響Fig.1 Effects of Tau on total protein content and protein synthesis rate in C2C12 cells圖1 Tau對C2C12細胞總蛋白質含量和蛋白質合成速率的影響Fig.1 Effects of Tau on total protein content and protein synthesis rate in C2C12 cells圖1 Tau對C2C12細胞總蛋白質含量和蛋白質合成速率的影響Fig.1 Effects of Tau on total protein content and protein synthesis rate in C2C12 cells

A-Western blot檢測添加不同濃度Tau后C2C12細胞中蛋白質合成速率變化；B-通過灰度掃描量化蛋白質合成速率變化水平；C-使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測添加不同濃度Tau后C2C12細胞中總蛋白質含量。數據用平均值±均方差表示，3次重復試驗，不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同。

A-Protein synthesis rate in C2C12 protein levels were analyzed by Western blot analysis using an antibody against puromycin.B-The Western blot was quantified by gray scale scanning.C-The total protein content in C2C12 cells was detected by the BCA protein concentration determination kit after taurine was added at different concentrations.Data were the means±SD from three independent experiments.Values with different lowercase letter indicated significant difference(P＜0.05).The same as below.

圖2 Western blot檢測添加不同濃度Tau對mTOR、p-mTOR和ARID4B表達的影響Fig.2 Effects of different concentrations of Tau on the expression of mTOR,p-mTOR and ARID4B by Western blot analysis

2.3 ARID4B干擾片段篩選2.3 ARID4B干擾片段篩選2.3 ARID4B干擾片段篩選

ARID4B基因干擾片段由蘇州吉瑪公司設計合成，共設計3條siRNA片段，通過轉染和Western blot試驗，篩選出ARID4B-siRNA-2（正義鏈：5' GCGGACAACUAGUUUCUAUTT 3'，反義鏈：5' AUAGAAACUAGUUGUCCGCTT 3'）為ARID4B干擾效果最佳siRNA片段，結果見圖3。選擇該干擾片段用于后續試驗。

2.4 添加Tau并敲低ARID4B對C2C12細胞總蛋白質含量和蛋白質合成速率的影響

添加Tau并敲低ARID4B，24 h后收集細胞樣品，使用SUnSET法檢測敲低ARID4B后C2C12細胞蛋白質合成速率，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測C2C12細胞總蛋白質含量。結果表明，添加最適濃度Tau提高蛋白質合成速率，敲低ARID4B阻斷Tau對C2C12細胞蛋白質合成的促進作用（見圖4A和B）。添加最適濃度Tau后，總蛋白質含量升高，敲低ARID4B阻斷Tau對C2C12細胞總蛋白質含量的促進作用（見圖4C）。結果說明ARID4B介導Tau提高C2C12細胞總蛋白質含量和蛋白質合成速率。

2.5 添加Tau并敲低ARID4B對相關信號通路表達變化的影響

添加Tau并敲低ARID4B后，C2C12細胞mTOR磷酸化變化趨勢與mTORmRNA水平變化趨勢相同，如圖5所示。添加最適濃度Tau后，mTOR磷酸化水平顯著升高，ARID4B敲低后，不僅降低mTOR磷酸化作用，且消除添加Tau對mTOR磷酸化的刺激作用（見圖5A-C）。敲低ARID4B也阻斷Tau對mTORmRNA表達水平促進作用（見圖5D）。結果表明，ARID4B敲低阻斷Tau對mTOR磷酸化和mTORmRNA表達促進作用。

圖3 ARID4B干擾片段篩選Fig.3 Screening of ARID4B interference fragments

圖4 ARID4B敲低對Tau調節C2C12細胞總蛋白質含量和蛋白質合成速率的影響Fig.4 Effects of ARID4B knockdown on the stimulation of Tau on total protein content and protein synthesis rate of C2C12 cells

圖5 敲低ARID4B基因對C2C12細胞mTOR磷酸化和mTOR mRNA表達的影響Fig.5 Effects of ARID4B knockdown on mTOR phosphorylation and mTOR mRNA expression in C2C12 cells

3 討 論

3.1 Tau對C2C12細胞蛋白質合成的影響

研究表明，氨基酸通過G蛋白偶聯受體（GPCRs）、氨基酸轉運體等調控細胞信號轉導通路，如PI3K、mTOR等信號轉導途徑[14]。早期研究表明Leu、Met、Lys、Arg、Ile等均可刺激mTOR磷酸化，其中Leu是主要激活mTOR的氨基酸[15]。Leu可提高mTOR通路中S6K1磷酸化水平，促進大鼠骨骼肌中蛋白合成，改善大鼠生長性能[16]。本研究發現，當Tau濃度低于120μmol·L-1時，Tau劑量依賴性促進C2C12細胞總蛋白質含量和蛋白質合成速率。低濃度Tau促進mTOR磷酸化，在Tau濃度為120μmol·L-1處達到峰值，后逐漸下降，表明Tau劑量依賴性促進C2C12細胞蛋白質合成。Ulrike等報道顯示，過量Tau可被氧化為可能具有細胞毒性的羥乙基磺酸和磺基乙醛[17]。p-mTOR蛋白水平受Tau刺激而改變，而mTOR蛋白水平無顯著變化，與本研究結果一致[18]。表明Tau劑量依賴性促進C2C12細胞中蛋白質合成，而過量Tau對蛋白質合成有抑制作用。

3.2 ARID4B介導Tau對成肌細胞C2C12蛋白質合成的影響

轉錄因子ARID4B具有多種調控作用，Wu報道ARID4A和ARID4B在小鼠正常發育和生理過程中具有重要作用[12]。本研究中，向C2C12細胞中添加最適濃度（120μmol·L-1）Tau后，細胞內總蛋白質含量以及蛋白質合成速率顯著提高。ARID4B敲低后，細胞內總蛋白質含量以及蛋白質合成速率顯著減少。通過Western blot試驗進一步分析，ARID4B敲低后，mTOR磷酸化也顯著降低。結果顯示，ARID4B敲低不僅消除蛋白質合成功能，還消除Tau促進作用。綜合以上數據表明，ARID4B介導Tau通過調控mTOR磷酸化促進C2C12細胞蛋白質合成。本試驗發現Tau劑量依賴性調節ARID4B表達水平，但具體分子機理尚不清楚，有待進一步研究。

3.3 ARID4B介導Tau對C2C12細胞mTOR mRNA表達的影響

通過qRT-PCR試驗發現，mTORmRNA水平在ARID4B敲低后也顯著減少，ARID4B敲低也顯著抑制Tau對mTORmRNA表達促進作用。Liang等研究報道ARID4B正向調節PI3K表達，且是PI3K亞基PIK3CA和PIK3R2轉錄激活因子[19]；ARID4B等位基因與組蛋白脫乙?；笍秃衔锍蓡TmSIW3A和MSDS3結合調節基因表達[19]。因此，推斷ARID4B介導Tau可能通過調節mTOR基因轉錄促進mTOR磷酸化，也可能激活mTOR上游PI3K基因表達從而促進mTOR磷酸化。ARID4B調節C2C12細胞蛋白質合成調控方式有待進一步研究。

4 結 論

本研究揭示Tau劑量依賴性促進C2C12細胞蛋白質合成。ARID4B介導Tau正向調節mTOR磷酸化以及mTORmRNA表達水平，促進C2C12細胞的蛋白質合成，同時揭示ARID4B介導Tau調節成肌細胞蛋白質合成功能和作用機理，為Tau作為飼料添加劑提高畜禽產肉量性狀提供理論依據。