基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的血必清注射液治療新型冠狀病毒感染合并心肌炎的作用機(jī)制研究

唐超 蔡琳 張藝文 汪漢

(西南交通大學(xué)附屬醫(yī)院 成都市第三人民醫(yī)院心內(nèi)科 成都市心血管病研究所，四川 成都 610031)

2019年底開始，新型冠狀病毒肺炎從湖北武漢迅速傳播到中國各省及全球，嚴(yán)重危害到了人類健康。本次由2019新型冠狀病毒(2019-nCoV)引發(fā)的疾病被世界衛(wèi)生組織命名為2019冠狀病毒病(corona virus disease 2019，COVID-19)。2019-nCoV與引起嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)和中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome，MERS)的冠狀病毒關(guān)系密切，同為β屬冠狀病毒，并且具有相同的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)受體[1]。COVID-19在流行病學(xué)上表現(xiàn)為潛伏期長、傳染性強(qiáng)和人群普遍易感的特點(diǎn)，從中醫(yī)觀點(diǎn)看，歸于“疫病”范疇。患者感染2019-nCoV后不僅有發(fā)熱、乏力和干咳等典型的臨床表現(xiàn)，還有與病毒感染相關(guān)的心臟受損的癥狀，其中，心肌炎是COVID-19患者心臟受損的重要表現(xiàn)之一[2]，其可能的發(fā)病機(jī)制為全身炎癥反應(yīng)。而血必清注射液具有補(bǔ)脾益氣和清熱解毒的功效，臨床上用于治療因呼吸系統(tǒng)疾病和泌尿系統(tǒng)疾病等感染引起的全身炎性反應(yīng)綜合征，對因感染、創(chuàng)傷和燒傷等引起的多器官功能障礙綜合征(瘀毒互結(jié)和熱毒內(nèi)陷證)患者的器官功能受損期和衰竭早期也有一定作用，推測血必清注射液可能是2019-nCoV感染合并心肌炎的一種潛在治療藥物[3]。

血必清注射液是紅花、赤芍、川芎、丹參和當(dāng)歸等中藥材提取物，主要成分為紅花黃色素A等，用于溫?zé)犷惣膊。Y見發(fā)熱、喘促、心悸和煩躁等瘀毒互結(jié)證，適用于因感染誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征，也可配合治療多器官功能失常綜合征的臟器功能受損，但其作用機(jī)制尚不明確[4]。在治療2019-nCoV感染的處方中，血必清注射液是新冠2號和新冠3號的推薦中成藥[5]。因中藥所含有效成分復(fù)雜，僅通過實(shí)驗(yàn)對其作用機(jī)制進(jìn)行全面研究較為困難，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)則融合了藥理學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、計(jì)算機(jī)生物學(xué)及網(wǎng)絡(luò)分析等多學(xué)科的技術(shù)和內(nèi)容，通過構(gòu)建“藥物-活性成分-靶標(biāo)-疾病”多層網(wǎng)絡(luò)來分析藥物作用于疾病的機(jī)制。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)分析，為血必清注射液的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP)(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)，UniProt數(shù)據(jù)庫(UniProt，https：//www.uniprot.org/),GeneCards數(shù)據(jù)庫(GeneCards，https：//www.genecards.org),OMIM數(shù)據(jù)庫(OMIM，https：//www.omim.org),Cytoscape 3.6.1軟件(Cytoscape，https：//cytoscape.org),STRING數(shù)據(jù)庫(String，https：//string-db.org/)和R 3.6.2軟件(R，https：//www.r-project.org)。

1.2 藥物活性成分及靶點(diǎn)

TCMSP可提供中藥主要成分、靶點(diǎn)和疾病的信息，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug likeness，DL)是篩選藥物主要成分常用的參數(shù)。借助TCMSP數(shù)據(jù)庫分別檢索血必清注射液的主要組成成分：紅花、赤芍、川芎、丹參和當(dāng)歸，篩選出OB≥30%和DL≥0.18的化合物作為血必清注射液的主要成分，并根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫中的“related targets”功能，篩選出與其化合物相對應(yīng)的靶點(diǎn)。此外，利用UniProt數(shù)據(jù)庫把靶點(diǎn)蛋白名稱統(tǒng)一轉(zhuǎn)化為基因名稱，刪除部分不規(guī)范的靶點(diǎn)。

1.3 疾病靶點(diǎn)的預(yù)測

GeneCards數(shù)據(jù)庫收錄了較全面的人類基因信息，包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和遺傳學(xué)等。OMIM數(shù)據(jù)庫主要對人類基因和表型及其之間的關(guān)系進(jìn)行了全面描述。在GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫中分別檢索2019-nCoV和心肌炎，然后把兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的檢索內(nèi)容合并取交集，交集所得結(jié)果即2019-nCoV感染合并心肌炎的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的靶點(diǎn)預(yù)測

藥物和疾病的共同靶點(diǎn)即藥物作用于疾病的潛在靶點(diǎn)。通過使用R軟件中的“VennDiagram”安裝包對血必清注射液和2019-nCoV感染合并心肌炎的靶點(diǎn)取交集，兩者的共同靶點(diǎn)即血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.5 可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)能更明確地顯示藥物和疾病之間復(fù)雜的相互關(guān)系。藥物的活性成分可直接或間接作用于疾病靶點(diǎn)從而發(fā)揮治療作用，而疾病的形成和治療與其靶點(diǎn)也有著直接或間接的關(guān)系。血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的相關(guān)靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫來構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，物種設(shè)置為“人”(“Homo sapiens”)。根據(jù)靶點(diǎn)蛋白相互作用連線數(shù)目進(jìn)行排序，連線數(shù)目越大表示該靶點(diǎn)蛋白在藥物治療疾病過程中所起作用越大，選用蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中連線數(shù)目最多的30個(gè)靶點(diǎn)蛋白作為關(guān)鍵靶點(diǎn)。利用Cytoscape軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)主要包括藥物、藥物活性成分、疾病及其靶點(diǎn)四類節(jié)點(diǎn)，兩節(jié)點(diǎn)之間均以邊相連。

1.6 基因本體及通路富集分析

基因本體(gene ontology，GO)富集分析常用于注釋基因及其基因產(chǎn)物的功能，包括分子功能、生物過程和細(xì)胞組分三個(gè)生物學(xué)范疇。京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)可對靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析，有利于探索藥物治療疾病的作用機(jī)制。利用R軟件的“clusterProfiler”“DOSE”和“pathview”安裝包對血必清注射液治療2019-nCoV感染合并心肌炎的靶基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析，并以P<0.05作為篩選條件，將前20條富集顯著的結(jié)果進(jìn)行圖表可視化。

2 結(jié)果

2.1 血必清注射液的活性成分及靶點(diǎn)

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫分別檢索血必清注射液的主要組成成分：紅花、赤芍、川芎、丹參和當(dāng)歸，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為篩選條件，刪除無相對應(yīng)靶點(diǎn)的化合物、重復(fù)或無相對應(yīng)基因名稱的靶點(diǎn)蛋白，最終獲得125個(gè)符合條件的有效成分(紅花22個(gè)，赤芍29個(gè)，川芎7個(gè)，丹參65個(gè)，當(dāng)歸2個(gè))，其對應(yīng)6 933個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)(紅花1 466個(gè)，赤芍681個(gè)，川芎1 356個(gè)，丹參2 566個(gè)，當(dāng)歸864個(gè))，共215個(gè)靶基因。

2.2 2019-nCoV感染合并心肌炎的靶點(diǎn)

利用GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫分別檢索COVID-19和心肌炎，并把兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果合并，獲得COVID-19相關(guān)基因359個(gè)，心肌炎相關(guān)基因1 062個(gè)，然后把以上兩種疾病的相關(guān)基因取交集，最終獲得2019-nCoV感染合并心肌炎的靶基因177個(gè)。

2.3 血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的相關(guān)靶點(diǎn)及“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

對215個(gè)血必清注射液的靶基因和177個(gè)2019-nCoV感染合并心肌炎的相關(guān)基因進(jìn)行Venn分析，獲得41個(gè)疾病和藥物的共同基因，即為血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的潛在靶點(diǎn)，其對應(yīng)血必清注射液化合物71個(gè)。將疾病、藥物以及篩選得到的藥物活性成分、疾病和藥物的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，見圖1。網(wǎng)絡(luò)中共有78個(gè)節(jié)點(diǎn)(35個(gè)化合物、41個(gè)靶點(diǎn)、1個(gè)疾病和1個(gè)藥物)，235條邊，不同形狀(或不同顏色)的節(jié)點(diǎn)分別代表藥物、藥物活性成分、靶點(diǎn)和疾病。

注：長方形節(jié)點(diǎn)：血必清注射液活性成分；圓形節(jié)點(diǎn)：疾病-藥物的共同靶點(diǎn)。圖1 藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

通過將疾病和藥物的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)定物種為人，并隱藏蛋白互作得分<0.4的邊，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中有41個(gè)相互作用節(jié)點(diǎn)，496個(gè)邊，結(jié)果見圖2。網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)代表不同的靶點(diǎn)蛋白，不同顏色的邊代表不同的相互作用類型，靶點(diǎn)蛋白間相互作用連線的數(shù)目與該靶點(diǎn)在藥物治療疾病過程中所起作用相關(guān)。按照相互作用連線的數(shù)目大小進(jìn)行排序，選用連線數(shù)目最多的30個(gè)靶點(diǎn)蛋白作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，包括白介素(IL)-6、IL-10、白蛋白(ALB)、C-X-C基序趨化因子8(CXCL8)、IL-1β、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、胱天蛋白酶3(CASP3)、趨化因子2(CCL2)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、γ干擾素(IFN-γ)、IL-4、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、胱天蛋白酶8(CASP8)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、轉(zhuǎn)錄因子(RELA)、原癌基因(FOS)、IL-2、過氧化氫酶(CAT)、表皮生長因子受體(EGFR)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子1-α/β(STAT1)、血紅素加氧酶1(HMOX1)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(NOS2)、C-X-C基序趨化因子10(CXCL10)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、纖溶酶原激活物抑制物1(SERPINE1)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(NOS3)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、雌激素受體1(ESR1)、CD40配體(CD40LG)和干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF1)，并將上述靶點(diǎn)蛋白做出柱狀圖，見圖3。

注：節(jié)點(diǎn)：靶點(diǎn)蛋白；不同顏色的邊：不同的相互作用類型。圖2 血必清注射液治療2019-nCoV感染合并心肌炎的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

注：橫坐標(biāo)：相互作用連線的數(shù)目；縱坐標(biāo)：靶點(diǎn)蛋白。圖3 血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.5 GO及KEGG富集分析

利用R軟件對血必清注射液治療2019-nCoV感染合并心肌炎的相關(guān)基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析，兩者均以P<0.05作為篩選條件，P值越小富集越顯著，在其功能或通路上的基因越多。在GO富集分析中含有71個(gè)生物學(xué)過程，根據(jù)P值大小進(jìn)行排序，選取富集前20位的生物學(xué)過程，見表1。表1顯示，血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎，主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體配體活性、磷酸酶結(jié)合和趨化因子受體結(jié)合等多種生物學(xué)過程。KEGG富集通路發(fā)現(xiàn)，41個(gè)疾病-藥物共同靶點(diǎn)顯著富集在135條通路上，其中前20條富集顯著通路的具體信息見圖4。縱軸為通路名稱，橫軸為基因比值。基因比值的大小表示富集程度的高低，點(diǎn)的大小表示富集的靶點(diǎn)基因數(shù)量，點(diǎn)的顏色從紅色到藍(lán)色表示P值從小到大。血必清注射液在治療2019-nCoV感染合并心肌炎中主要通過糖尿病并發(fā)癥相關(guān)的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、Chagas病和甲型流感等疾病相關(guān)通路發(fā)揮作用。

3 討論

隨著計(jì)算機(jī)信息學(xué)的迅速發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為研究中藥的多成分及復(fù)雜的作用機(jī)制提供了新的研究方法。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從整體考慮藥物與疾病的相關(guān)性，強(qiáng)調(diào)藥物、靶點(diǎn)與疾病間相互作用的系統(tǒng)性，反映中成藥的多成分、多靶點(diǎn)和多通路的作用特點(diǎn)[6]。因此，本研究首先使用TCMSP數(shù)據(jù)庫對血必清注射液的中藥活性成分進(jìn)行篩選；運(yùn)用GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫對疾病靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測篩選，構(gòu)建活性成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。將得到的靶點(diǎn)利用STRING進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并進(jìn)行GO和KEGG富集分析，構(gòu)建靶點(diǎn)信號通路網(wǎng)絡(luò)圖，從而發(fā)現(xiàn)血必清注射液主要的活性成分、主要作用的靶點(diǎn)和調(diào)節(jié)的通路。具體發(fā)現(xiàn)有：血必清注射液5個(gè)最主要的中藥活性成分為：紅花、赤芍、川芎、丹參和當(dāng)歸。研究結(jié)果顯示血必清注射液與2019-nCoV感染合并心肌炎的交集靶點(diǎn)共有41個(gè)，其對應(yīng)血必清注射液的活性成分主要包括槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、山奈酚和黃芩素等。研究表明血必清注射液可通過調(diào)節(jié)免疫功能發(fā)揮抗病毒作用，且有明確的抗炎機(jī)制，可能作為COVID-19的潛在抑制劑[7]。槲皮素具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫和保護(hù)心肌缺血再灌注損傷等作用。槲皮素可通過抑制核因子κB信號通路減少核因子κB的產(chǎn)生，從而達(dá)到抗炎的作用[8]。木犀草素能抑制流感病毒的增殖和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，影響Toll樣受體通路和凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，減輕病毒對宿主細(xì)胞的免疫損傷，發(fā)揮抗病毒作用[9]。β-谷甾醇對脂多糖致急性肺損傷有一定的保護(hù)作用，亦可改善非酒精性脂肪肝患者肝細(xì)胞脂肪變性程度，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而對肝臟起到保護(hù)作用[10]。研究表明，山奈酚具有良好的抗菌活性，對耐甲氧青霉素的金黃色葡萄球菌也有作用，在抗病毒方面，山奈酚在非細(xì)胞毒性濃度呈濃度依懶性抑制。黃芩素可減弱炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及肺組織細(xì)胞凋亡，可能通過抑制p38 MAPK通路發(fā)揮對肺組織的保護(hù)作用[11]；同時(shí)可抑制新生血管形成，通過降低血壓和擴(kuò)張血管等方式發(fā)揮保護(hù)心腦血管的作用；亦可直接清除活性氧，減輕缺血再灌注心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高心肌細(xì)胞的生物功能和存活率[12]。

表1 血必清注射液治療2019-nCoV感染合并心肌炎的主要生物學(xué)過程(前20個(gè))

通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析篩選出血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)，包括IL-6、IL-10、ALB、CXCL8和IL-1β等，分析發(fā)現(xiàn)這些靶點(diǎn)主要與炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)控以及細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等密切相關(guān)。IL-6和IL-10在炎癥反應(yīng)中起重要作用，能參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖和分化[13]。研究表明宿主細(xì)胞可通過蛋白的泛素化修飾抑制MAPK/ERK通路，從而抑制病毒感染[14]。

GO和KEGG富集結(jié)果表明血必清注射液通過多種生物學(xué)過程和多條信號通路參與2019-nCoV感染合并心肌炎的治療過程。從GO富集分析結(jié)果可得知，共同靶點(diǎn)主要涉及生物學(xué)過程有細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體配體活性、磷酸酶結(jié)合和趨化因子受體結(jié)合等。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的靶點(diǎn)主要涉及糖尿病并發(fā)癥相關(guān)的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、Toll樣受體信號通路及多種疾病等多條通路。其中，糖尿病并發(fā)癥相關(guān)的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路和TNF信號通路已被證實(shí)與2019-nCoV感染相關(guān)[15]。糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路與血管損傷、炎癥反應(yīng)和動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)，通路激活可導(dǎo)致活性氧過量產(chǎn)生，核因子κB活化，黏附因子和細(xì)胞因子表達(dá)增加[16]。TNF信號通路和IL-17信號通路均能調(diào)控細(xì)胞凋亡，是炎癥反應(yīng)過程中重要的通路。Toll樣受體信號通路是免疫反應(yīng)過程中的重要通路，三萜類化合物可通過Toll樣受體信號通路減輕脂多糖引起的心肌功能障礙[17]。由此推測，血必清注射液是通過抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫功能和調(diào)控細(xì)胞凋亡來治療2019-nCoV感染合并心肌炎。

圖4 血必清注射液治療2019-nCoV感染合并心肌炎的主要通路(前20條)

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討了血必清注射液作用于2019-nCoV感染合并心肌炎的活性成分及可能的作用機(jī)制，結(jié)果顯示血必清注射液的主要活性成分為槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、山奈酚和黃芩素，其主要通過調(diào)節(jié)IL-6、IL-10、ALB、CXCL8、IL-1β、MAPK8和CASP3等靶點(diǎn)，調(diào)控AGE-RAGE、IL-17和TNF等信號通路來抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫功能和調(diào)控細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療2019-nCoV感染合并心肌炎的目的。本研究仍存在一定的局限性，如網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于數(shù)據(jù)進(jìn)行的研究，有關(guān)疾病和藥物的資料收集的結(jié)果可能不全面，以及通過數(shù)據(jù)庫篩選出的中藥活性成分可能與實(shí)際吸收進(jìn)入人體循環(huán)的藥物成分有差異。因此仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證本研究結(jié)果。