內皮微粒在臨床中的研究進展及應用

于博文 修成奎 王雪 楊靜 雷燕

(1.中國中醫科學院醫學實驗中心 北京市中醫藥防治重大疾病基礎研究重點實驗室，北京 100700； 2.中國中醫科學院博士后科研流動站，北京 100700)

細胞間通訊包括細胞間直接接觸和細胞外分泌，近年來，以內皮微粒(endothelial microparticles，EMP)為媒介的細胞間通訊日益受到關注。EMP由內皮細胞產生，能通過多種方式影響受體細胞的功能。鑒于這種調節細胞功能的潛力，學者們認為EMP可作為內皮功能障礙和血管健康的生物標志物，也可預測多種疾病并判斷預后。但目前對EMP分子機制的理解還不夠深入，在其研究及檢測方法上存在局限性。現就近年EMP的研究進展進行綜述，為臨床診療提供一些思考，以期推進EMP作為疾病靶標的轉化醫學研究。

1 EMP概述

1.1 EMP的概念和病理生理功能

細胞外囊泡是脂質雙分子層包繞形成的球狀膜性囊泡，由細胞分泌產生并釋放到細胞外環境中，在血液、尿液、乳汁、唾液、精液、關節液或腦脊液中均可被檢測到。根據其來源、大小和成分，通常分為外泌體、微粒和凋亡小體。微粒是從激活或損傷的細胞上脫落的微小囊泡，由細胞膜向外出芽形成，直徑0.1～1 μm，含胞漿、膜蛋白、RNA和microRNA等。微粒表面具有母體細胞來源的膜磷脂結構和蛋白質成分，并攜帶有母體細胞源的膜表面分子標志物[1]。1976年，Wolf[2]首次證實來源于活化血小板的血小板微粒，并將其命名為“血小板塵埃”。1999年，Combes等[3]首次發現用腫瘤壞死因子-α刺激臍靜脈內皮細胞能促使其釋放EMP。迄今為止，血小板、淋巴細胞、巨噬細胞、血管內皮細胞、平滑肌、視網膜、祖細胞和癌細胞等各種類型細胞均被證明可釋放微粒，并根據其細胞來源命名為EMP和血小板微粒等[4]。

EMP在生理情況下數量較少，近幾年研究發現，這些經常被忽視的EMP正逐漸成為內皮功能失調的潛在指標，是反映內皮損傷的新標志物。EMP可參與細胞間信息傳遞，具有促凝活性，調節凝血與抗凝系統的平衡，且能介導炎癥反應，在血管損傷及生成等過程中也發揮重要的作用[5]。在病理情況下，血管內皮細胞受到外界刺激進后產生的較高水平EMP，可參與各種病理過程，如可通過一氧化氮生物利用度受損，暴露促凝血劑[磷脂酰絲氨酸(PS)或組織因子(TF)]，或轉移p38絲裂原活化蛋白激酶，影響內皮的動脈粥樣硬化保護功能[6-7]。

1.2 EMP的形成和釋放

EMP的形成和釋放機制尚不十分清楚，主要依賴于體外培養內皮細胞的研究。除最早發現的腫瘤壞死因子-α外，其他炎性細胞因子[8]、細菌脂多糖[9]、活性氧[10]、纖溶酶原激活物抑制劑[11]、凝血酶[12]以及腫瘤來源的微粒[13]都可導致EMP的產生。另外，物理性刺激如低剪切應力和輻射等也可刺激EMP的釋放[14-15]。

目前研究表明，EMP釋放到細胞外液的具體過程為：細胞受到上述化學性或物理性刺激后，膜鈣通道開放引起鈣內流，從而激活鈣蛋白酶，觸發細胞骨架蛋白(如收縮蛋白和纖維肌動蛋白)的局部降解；同時，膜不對稱性喪失，質膜磷脂的不對稱分布被改變，使PS被轉移到外層而不能用于與收縮蛋白結合[16]；最后，激活的肌動球蛋白系統將囊泡的邊緣聚集在一起，以出芽的方式釋放EMP[17]。在該過程中，flipase、floppase和scramblase這三種酶的抑制或激活對維持質膜不對稱性至關重要[18]。此外，PS的暴露是通過Rho A重組肌動蛋白細胞骨架來調節，Rho的激活是炎癥條件下微粒脫落或凋亡的關鍵因素[19]。

目前對刺激EMP釋放的信號轉導分子機制研究較少，例如，氯吡格雷可通過抑制p38絲裂原活化蛋白激酶途徑抑制硫酸吲哚酚誘導的EMP生成[20]。凝血酶通過依賴于RhoA/ROCKⅡ軸的信號通路誘導EMP釋放[12]。在凝血酶激活的內皮細胞中也有TRAIL/Apo2L通路的激活，最終白介素(IL)-1和TRAIL以自分泌或旁分泌的方式，刺激EMP的分泌[21]。

2 EMP在臨床中的研究進展及應用

2.1 EMP信使作用表現為促炎、促凝及影響血管生成

EMP信使作用的物質基礎是其含有豐富的母體細胞來源的胞膜成分及胞質成分，如表面受體、白細胞分化抗原分子(CD)、PS、TF、細胞因子、脂質及mRNA和microRNA等[5]。EMP可作為“傳送器”和“信號體”，通過激活受體和/或直接將微粒內容轉移到靶細胞，傳遞參與細胞黏附、趨化和血管生成的生物活性分子，同時將信息從微粒釋放細胞傳遞給靶細胞，補充了傳統的細胞間通訊途徑。因此，雖然EMP只代表外周循環中的一小部分細胞微粒，但仍被認為是向周圍環境傳遞重要生物學信息的載體[1]。

然而，目前尚不清楚EMP是否通過旁分泌途徑或細胞與EMP的直接接觸，從而對其靶細胞產生影響。有研究表明，EMP可通過將蛋白質轉移到內皮細胞表面而起作用，EMP還能通過暴露膜結合分子間接影響靶細胞，并最終激活靶細胞受體從而誘導特異性反應[22]；也有研究證實其作用機制類似于吞噬作用，涉及清道夫受體或PS受體[23]。此外，EMP和靶細胞之間的膜融合也可能觸發細胞活化[24]。因此，概括EMP靶向效應細胞的機制可能有兩種：第一種是通過微粒與膜受體或整合素的相互作用，刺激細胞內信號傳導；第二種是通過膜融合或內吞作用，將微粒中的成分“清空”到受體細胞的胞質中。

EMP的信使作用主要表現在促炎、促凝反應以及影響血管生成等方面。研究證實，腫瘤壞死因子-α刺激產生的EMP可作為旁分泌介質，通過上調細胞間黏附分子-1、microRNA的表達和從靶細胞脫落的可溶性細胞間黏附分子-1，誘導內皮細胞發生炎癥反應，而非刺激條件下產生的EMP無此作用[25-26]。因此，這種旁分泌效應受EMP產生條件的影響，提示EMP既是炎癥反應的原因又是結果。此外，EMP還可作為血管生成的信號，通過激活參與細胞外基質降解和生長因子釋放的基質金屬蛋白酶，在組織重塑和血管生成中起關鍵作用[27]。

EMP還可介導促凝，活化細胞產生的EMP在體外可誘導TF依賴性凝血酶形成，在體內則誘導血栓形成，這表現為正常血漿的凝固時間隨EMP含量的增加而縮短。由于內皮黏附分子的表達，TF+EMP可與單核細胞等其他細胞結合，從而增強促炎和促凝反應[28]；這種促凝血反應也可能與TF從TF+EMP上轉移到活化血小板上有關[29]。此外，EMP富含PS的表面可催化凝血蛋白及其復合物的組裝[6]。因此，通過暴露PS和TF，EMP可能作為生物載體在促凝潛能的傳播中發揮作用。

2.2 EMP是新的生物標志物及臨床預測指標

EMP是內皮功能障礙及血管健康的新的生物標志物。評估內皮功能障礙的傳統方法有：多普勒血流檢測內皮依賴性血管舒張、靜脈閉塞造影、正電子發射斷層顯像冠狀動脈灌注冷加壓試驗、激光多普勒血流測量和超聲等[30]。這些評估方法的缺陷在于具有侵襲性，并且與實際內皮功能相關性差，因此需新的內皮功能替代指標。而揭示EMP在內皮功能障礙中的生物學意義可能預示著血管健康、風險分層和疾病進展的新型無創監測平臺的出現。EMP亞群的計數和表型分類與許多疾病中的內皮功能障礙有關。在出現內皮功能障礙的患者中，循環EMP水平與血流介導的擴張幅度呈負相關，與年齡和壓力無關[31]。對年輕健康受試者，急性內皮損傷如二手煙會迅速損害內皮功能并增加循環EMP水平[32]。近年來，結合EMP和內皮祖細胞水平的多標志策略作為血管健康的綜合標志物也引起了人們的關注。EMP與內皮祖細胞比值的變化可能反映了內皮損傷和修復之間的不平衡，這可能有助于鑒別血管損傷[33]。

EMP還可作為多種疾病的生物標志物及預測指標，在冠狀動脈疾病、心肌梗死、血栓、慢性心力衰竭、肺動脈高壓、卒中、高血壓、糖尿病以及腎衰竭等多種疾病中，EMP被視為各病理過程正在進展或過度激活的潛在生物標志物[34]。目前心血管危險分層使用的非特異性指標，如Framingham危險評分、腦鈉肽和高敏C反應蛋白，在預測冠心病高危穩定患者心血管并發癥的發生方面是不夠的。Nozaki等[35]報道血漿EMP水平可獨立預測冠心病高危患者未來心血管事件，用EMP評估內皮功能障礙的多種生物標志物策略可識別易患心血管疾病的人群。此外，在無癥狀個體中，循環EMP與動脈粥樣硬化血栓形成風險增加相關，因此可能提供潛在的預測價值[36]。

2.3 EMP用于判斷預后

部分研究也探討了血漿EMP水平的預后判斷潛力。在轉移性乳腺癌患者中，化療后循環EMP水平的降低與更好的總體生存率和無病生存率相關，并且可能作為血管生成相關的預后指標，效果優于血管內皮生長因子A水平[37]。在冠心病高風險受試者中，表達血管內皮鈣黏蛋白的EMP基線水平可判斷預后，并且與Framingham危險評分、C反應蛋白和腦鈉肽水平無關[38]。在慢性腎功能衰竭中也有類似的發現，其中高水平CD31+CD41-EMP是心源性死亡的獨立預測因子，而其他血漿微粒亞群則無預后判斷價值[39]。綜上，EMP在內皮功能、多種疾病及預后中均可作為一種評價和預測指標。

2.4 EMP在臨床治療中的價值

EMP評價可為有癥狀和無癥狀患者的臨床治療提供一定的參考，監測導致EMP形成的過程可能與控制疾病進展有關，靶向EMP的治療手段可能是一項新的挑戰。研究表明，黃連素可通過減少循環CD31+/CD42-EMP介導的血管內皮氧化應激，改善內皮功能[40]。抗氧化劑(如維生素C)可改善糖尿病患者和心肌梗死后血脂異常患者的循環EMP水平[41]。他汀類藥物對EMP釋放也有影響，但仍存在爭議：一方面，臨床相關濃度的他汀類藥物可通過抑制異戊烯化作用，刺激內皮細胞分離和EMP釋放；另一方面，他汀類藥物可能對內皮細胞具有抗炎作用，抑制Rho激酶途徑，導致EMP釋放減少[42]。循環缺氧相關疾病(CHRD)，如急性冠脈綜合征、卒中和器官移植，與EMP也密切相關。EMP有助于CHRD表型的識別和疾病嚴重程度的分層，改善CHRD發生的危險分層及CHRD患者的預后[21]。Francois等[43]報道，限制碳水化合物可減少循環EMP，有效緩解餐后高血糖，并改善2型糖尿病患者的內皮功能。此外，微粒作為治療糖尿病相關心臟、腎臟、周圍神經和視網膜損傷的靶點，也顯示出巨大的前景。藥物控制細胞膜磷脂部分及微粒脫落過程可能有助于控制糖尿病腎病和血管老化[44]。

3 EMP的雙面作用

目前研究主要集中在病理狀態下的EMP上，因此EMP很容易被誤認為是純粹有害的。然而，健康個體中存在基本水平的EMP，具有潛在的細胞保護蛋白和受體[45]。EMP對內皮完整性也具有潛在有益作用，如刺激血管修復，控制細胞死亡機制或抗原呈遞細胞支持的細胞保護活性以及誘導適應性免疫。在膿毒癥中，EMP最初被認為是傳遞對內皮功能有害的生物信息，進而引發凝血和死亡。事實上，EMP通過攜帶功能性內皮蛋白C受體和抗原呈遞細胞在膿毒癥中具有有益的作用。此外抗原呈遞細胞陽性的EMP能抑制促凝微粒的釋放，并通過減少細胞凋亡對內皮細胞具有保護作用[46]。EMP還可通過Akt/eNOS信號和減少氧化應激預防脂質誘導的內皮損傷[47]。還有研究表明，EMP可利用血液代謝物合成還原型輔酶Ⅱ，為其抗氧化機制提供燃料。并且衰老EMP比年輕EMP具有更強的活性氧清除能力[48]。

EMP在促進血管生成方面也可能有雙面作用。EMP可能是缺血組織血管修復的內源性生存信號，但促進血管生成也可能對癌癥擴散、增殖性糖尿病視網膜病變或動脈粥樣硬化斑塊失穩產生影響[49]。以上研究表明，EMP在各種生理過程中具有復雜而矛盾的作用，可促進或抑制凝血、炎癥或血管生成。EMP具有有益作用的關鍵是其血漿水平保持適當平衡，過量或不足都會產生不利影響[45]。

4 EMP的檢測方法及在臨床研究中存在的問題

盡管顯微鏡、酶聯免疫吸附試驗及功能測定等方法均可用于微粒檢測，但流式細胞術是目前微粒分析的金標準，能分析大量微粒和提供有關微粒特性的信息，并可進行多重標記[50]。其具體方法為：首先用已知直徑的標準微球進行尺寸校準，圈定0.1～1 μm范圍的門；其次對EMP進行標記，同時定量。標記EMP常用的方法有兩種，一是當血管內皮細胞被不同病理因素刺激時，會產生不同表型的EMP，常被作為檢測EMP的標志物。用EMP自身帶有的特異性抗原標記抗體、結合及測定。常用的標志物有CD144+、CD106+、CD62E+和CD31+/CD42b-。二是用Annexin-V測定PS+EMP，Annexin-V是Ca2+依賴性的磷脂結合蛋白，與PS有超強的親和力。定量EMP也有兩種方法：一是在分析前的樣品中加入已知濃度和體積的微球，間接計算樣品微粒濃度；二是預先確定流式細胞儀的流速，則可計算每個分析體積的樣品微粒數[51]。

然而，目前EMP在臨床研究中存在一定的局限性。各種分析前變量，如樣本采集、離心轉速、緩沖液、試劑和凍融等因素均可能對分析結果產生影響[52]。此外，用Annexin-V分析EMP時只能檢測到表面帶有PS的EMP亞群，可能導致測量的不全面性。內皮細胞上Anexin-V結合位點的顯著增加只發生在凋亡中，并且優先富集在由凋亡內皮細胞衍生的EMP上，這可能導致因內皮細胞活化而釋放的EMP無法被檢測到[51]。EMP的異質性以及用單一標志物標記總EMP的效率低下，導致了當前臨床研究中EMP水平差異較大。因此，檢測方法的優化和標準化對于正確定量EMP具有重要意義。目前，對EMP體內釋放時間窗的研究還不多見，對循環中微粒清除機制的研究也很有限。

5 小結和展望

越來越多的證據表明，EMP是新的生物信息傳遞者并且與多種疾病病理過程密切相關。進一步研究EMP釋放和清除的具體觸發因素，探索EMP在何時以及如何發揮不同的作用，有助于將其生物學意義延伸至疾病風險分層和預測分析，從而全面地監測血管健康，在臨床癥狀明顯之前即可預知疾病。總的來說，目前對微粒的組成、產生和靶向性的理解非常有益。隨著研究的深入，EMP的作用將一步步被揭示，這可為日后評價疾病提供新的信息，為從新的角度看待疾病提供支點，也會為轉化醫學領域如診斷和治療開創新的契機。EMP成為藥物靶點或藥物載體的潛力令人期待，它開啟了許多研究領域，最終將使患者受益。