幽門螺桿菌抗菌藥物耐藥分子機制的研究進展

侯 寵 劉一品

濱州醫學院煙臺附屬醫院消化內科(264100)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)是一種革蘭陰性微需氧螺旋桿狀細菌，感染性強，可特異性定植于胃黏膜表面，與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關淋巴樣組織淋巴瘤、胃癌等上消化道疾病密切相關[1]。Maastricht Ⅴ/Florence共識已將Hp根除治療的范圍擴展至無癥狀感染者[2]。目前針對Hp的根除治療主要包括圍繞抗菌藥物為主的標準三聯療法(質子泵抑制劑+兩種抗菌藥物)和鉍劑四聯療法(質子泵抑制劑+鉍劑+兩種抗菌藥物)。目前，Hp在全球的感染率已過半。在我國，由于抗菌藥物濫用等一系列原因，Hp感染率已超過世界平均水平，臨床上對抗菌藥物的耐藥菌株越來越多見[3]。甲硝唑、克拉霉素以及左氧氟沙星的耐藥率分別已高達40%～70%、20%～50%以及20%～50%，且存在明顯的地域差異，雙重、三重、四重耐藥率逐年上升[4]。因此，解決抗菌藥物耐藥的問題已成為成功根除Hp的關鍵。本文就Hp抗菌藥物耐藥分子機制的研究進展作一綜述。

一、Hp的抗菌藥物耐藥機制

目前，用于根除Hp的抗菌藥物主要包括大環內酯類(如克拉霉素)、硝基咪唑類(如甲硝唑)、氟喹諾酮類(如左氧氟沙星)、阿莫西林、呋喃唑酮、四環素以及利福平。部分抗菌抗物可阻斷細菌核酸的合成如甲硝唑、利福平、左氧氟沙星；部分可阻斷細菌核糖體的合成如克拉霉素、四環素；部分可影響細菌細胞壁的合成如阿莫西林[5]。而抗菌靶基因發生突變、細胞屏障或外排系統發生改變、細菌球形變、誘導自噬以及與耐藥相關的酶或毒力因子的分泌等一系列原因均可使細菌逃避抗菌藥物的活性而導致細菌耐藥。

1.靶基因發生突變

①DNA促旋酶基因突變：DNA促旋酶屬細菌裂解酶，維持著細胞內正常的DNA螺旋結構，與DNA復制、轉錄、重組以及修復密切相關。有研究[6]表明，氟喹諾酮類藥物是有效的DNA促旋酶抑制劑，可導致不可逆性的細菌DNA損傷。DNA促旋酶基因由GyrA和GyrB兩個亞基構成，Hp DNA促旋酶基因突變，尤其是GyrA基因突變，可阻止氟喹諾酮類藥物與酶特異性結合，從而導致細菌耐藥。GyrB突變亦可導致Hp對氟喹諾酮類藥物耐藥，但通常與GyrA突變同時存在。GyrA耐藥決定區最常見的點突變為第87和第91位密碼子的突變[7]，其中第87位突變可能與Hp對氟喹諾酮類藥物高水平耐藥相關。此外，GyrA基因中第88和97位密碼子的突變、新發現的GyrA突變位點(如A129T、R140K、D192N、D34N、D161N、D34Y、R140K)以及GyrB基因突變(如D484K、F438S)均與氟喹諾酮耐藥密切相關[8-9]。

②RNA聚合酶基因突變：RNA聚合酶是一種由多個蛋白質亞基組成的復合酶，以Hp DNA為模板，與RNA轉錄密切相關。RNA聚合酶基因突變使RNA聚合酶上的抗菌藥物靶位發生構象改變，抗菌藥物無法與酶特異性結合，從而喪失抗菌作用。RNA聚合酶Pro基因編碼的B亞基突變是導致Hp對利福平耐藥的主要原因。目前發現第526～545、585、586、701以及149位密碼子突變均可使Hp對利福平耐藥，其中第526～545位突變起主導作用[10]。

③氧化還原酶編碼基因突變：氧化還原酶作為生物體內氧化還原體系中重要的催化酶，通過傳遞電子等一系列反應，在細菌的生長發育中發揮重要作用。部分抗菌藥物如甲硝唑，可從氧化還原反應中搶奪電子而發揮其抗菌活性，而氧化還原酶相關基因突變中斷了這一過程，使Hp逃避了抗菌藥物活性導致耐藥。在Hp中，氧化還原酶編碼基因主要包括rdxA、frxA以及fdxB[11]。rdxA編碼煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)亞硝基還原酶，frxA編碼NADPH黃素氧化還原酶，fdxB編碼類鐵氧體蛋白。其中rdxA基因突變是引起Hp對甲硝唑耐藥的主要原因，該基因突變使NADPH亞硝基還原酶活性降低，導致還原硝基的能力下降，不能取得足夠低的氧化還原電位，使甲硝唑無法還原生成具備殺菌活性的代謝產物[12]。然而相關研究[13]顯示，僅存在rdxA基因突變似乎不足以引起甲硝唑耐藥，可能需要其他因素協同作用。此外，有研究[14]發現frxA基因可增強rdxA突變株的耐藥性。

④核糖體RNA(ribosomal RNA,rRNA)編碼基因突變：rRNA是生物細胞中主要的核糖核酸之一，是一種具有催化能力的核糖酶，是參與生物體內蛋白質合成的重要結構。Hp作為一種原核生物，其rRNA分為5S rRNA、16S rRNA以及23S rRNA，Hp的耐藥性與16S rRNA和23S rRNA編碼基因突變有關。大環內酯類藥物的抗Hp機制是其與23S rRNA的Ⅴ結構域中的肽基轉移酶環可逆性結合，從而阻止肽鏈的延伸。而細菌23S rRNA編碼基因Ⅴ區的點突變會使核糖體構象改變，使抗菌藥物與核糖體的親和力減弱，核糖體內肽鏈得以延伸，細菌可完成蛋白質合成工作而抗菌藥物無法發揮完全的抗菌作用[15]。目前最常見的3個V區點突變為A2143G、A2142G以及A2142C[16]。多項研究[17-18]發現A2146C、A2146G、A2147G等一些新的突變位點與克拉霉素耐藥相關。同樣，16S rRNA編碼基因初始結合位點點突變可導致四環素耐藥，其主要的突變位點位于926～928位，AGA～TTC的三堿基發生變化[19]。此外，抗菌藥物耐藥水平與這3個堿基的突變數量有關，堿基替換數量越多，耐藥性越高[11,20]。

⑤細菌青霉素結合蛋白(penicillin-binding proteins,PBPs)編碼基因突變：PBPs是存在于細菌表面的一類膜蛋白，參與Hp細胞壁中肽聚糖的合成，在細菌生長、繁殖中發揮重要作用。通常情況下，阿莫西林與PBPs中的多溴聯苯共價結合，阻斷肽聚糖的合成，細菌細胞壁發生缺陷使細菌失去保護屏障而膨脹、破裂，從而發揮阿莫西林的抗菌作用。PBPs編碼基因突變使阿莫西林與PBPs的親和力減弱而發生耐藥。目前已鑒定出4種PBPs，分別為PBP1、PBP2、PBP3以及PBP4。其中PBP1A基因點突變是阿莫西林耐藥的主要機制[21]，這些點突變主要位于PBPs 3個結構域中的兩個區域中，分別是保守的殘基402～404和555～557，突變位點包括A369T、S414R、N562Y、D535N、S543R等[22-24]。此外，在PBP1突變的基礎上，PBP2和PBP3突變可發揮更強大的耐藥性[25]。

2.細胞屏障或外排系統發生改變使胞質內抗菌藥物濃度降低

①外膜蛋白(OMPs)發生改變：細菌的外膜是革蘭陰性菌細胞壁的特有結構，位于細菌質膜(內膜)和肽聚糖層的外側，包裹著整個細菌，是細菌重要的保護屏障。OMPs是細菌外膜的主要成分，包括脂蛋白、孔蛋白、鐵調節蛋白、泵蛋白等，在細菌的生命活動中起有重要作用。OMPs不僅可介導Hp黏附，是Hp感染致病的關鍵蛋白，而且與Hp耐藥密不可分[26]。研究[27]表明，Hp受抗菌藥物刺激后，可上調OMPs基因表達，OMPs高表達可增強細菌外膜屏障的保護作用，使抗菌藥物的滲透性進一步減弱，此是阿莫西林發生難治性耐藥和克拉霉素耐藥的另一種機制。OMPs基因HopB和HopC可使阿莫西林發生難治性耐藥，HopB、HofC以及OMP31可使克拉霉素發生耐藥[28]。

②細菌生物膜的形成：Hp感染人體后，附著于胃黏膜表面進行繁殖、分化，并向胞外分泌多糖基質如蛋白質、多糖、脂質、核酸以及一些保護性底物，菌體群落在這些胞外基質中互相黏附形成細菌聚集體膜狀物，稱為細菌生物膜。不同于浮游細菌，形成生物膜結構的菌群對外界惡劣環境有很強的適應能力，其中包括對抗菌藥物的抵抗防御。研究[29]顯示，有生物膜形成的菌體對抗菌藥物的耐藥性會增長10～1 000倍。此種高水平的耐藥可能與生物膜介導的多種耐藥機制相關：a.與OMPs高表達類似，生物膜的形成會給細菌提供更強的屏障保護作用。且有相關研究[30]表明生物膜的形成會促進OMPs的改變，進一步加強細菌對外界的防御能力。b.位于生物膜深層的細菌由于缺少營養物質和氧氣會處于休眠狀態。一般情況下，抗菌藥物僅對處于活動期的細菌有良好的抑菌、殺菌作用，而位于生物膜深層的休眠期細菌不易被殺滅。c.細菌生物膜可與外排泵聯合作用將進入生物膜中的抗菌藥物泵出，如克拉霉素[30]。d.此外，有研究[31]顯示生物膜的形成可能會誘導抗菌靶基因發生點突變以及生物膜胞外基質的一些酶水解抗菌藥物，但具體機制尚待進一步明確。

③外排泵的參與：細菌的外排泵是位于細胞膜上的一類多藥轉運蛋白，可將進入菌體的抗菌藥物泵出胞外，使菌體胞內抗菌藥物濃度降低而發揮耐藥作用。外排泵系統能參與多種抗菌藥物的泵出如阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素、四環素等，細菌發生雙重或多重耐藥的概率顯著增加[32]。Hp外排泵家族分為5類：耐藥結節分化(resistance nodulation-division,RND)家族、主要易化子超家族(major facilitator superfamily,MFS)、ATP結合盒(ATP-binding cassette,ABC)超家族、小多重耐藥(small multidrug resistance,SMR)家族以及多藥和毒性化合物外排(multidrug and toxic compound extrusion,MATE)家族[33]。RND家族中的AcrAB-TolC外排泵是Hp最主要的多重耐藥外排系統。hefABC、hefDEF以及hefGHI是3種編碼AcrAB-TolC外排泵系統的同源基因[34]。安瑩等[35]研究了敲除hefABC、hefDEF、hefGIH基因對Hp在克拉霉素耐藥中的影響，與野生株Hp26695相比，敲除基因后的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)明顯降低，證實了hef外排泵系統在克拉霉素耐藥中的作用。Kutschke等[36]測定了野生株和基因突變株對12種抗菌藥物的MIC值，結果發現70%的hefC基因突變株抗菌藥物MIC值出現下降，其中克林霉素、四環素、頭孢噻肟MIC值降低了8～16倍，證實了外排泵與細菌多藥耐藥的相關性。此外，有研究[37]顯示，有生物膜形成的菌株中外排泵基因Hp605、Hp971、Hp1327的表達明顯高于浮游株，提示外排泵與生物膜可發揮協同作用，以增加耐藥性。

3.Hp球形變：通常情況下，Hp是一種革蘭陰性螺旋桿菌，當外界環境不利于Hp的生長繁殖時，如缺少營養物質或氧氣、pH值改變、抗菌藥物干預等，螺旋形Hp會發生球形變，成為L形Hp[38]。球形Hp以兩種形式存在：一種已死亡或變性，另一種處于非活動期，致病力相對減弱且對抗菌藥物不敏感。目前認為處于非活動期的球形Hp在抗菌藥物治療期間啟動了耐藥逃逸機制，使抗菌藥物的滅菌活性顯著減弱。在停用抗菌藥物2～4周后球形Hp可恢復原有的形態和活性，故球形變是Hp耐藥、Hp長期慢性感染以及根除后復發的重要原因之一[39]。

4.誘導自噬：一般情況下，Hp感染人體后黏附于胃上皮細胞表面，是一種非侵襲性病原體。而有研究[40]顯示在完全清除細胞外的細菌后，細菌會重新出現于細胞外環境中。Wang等[41]的研究發現，Hp可在胃上皮細胞、巨噬細胞以及樹突細胞內存活和繁殖，提示Hp可介導自噬的發生。這些由于誘導自噬而存在于宿主細胞內的Hp可完美地避開細胞外抗菌藥物的清除作用，且在慢性感染期在自噬體內繼續存活繁殖造成持續或終身感染，提示在慢性感染期使用針對細胞內作用的抗菌藥物或許會為治療Hp持續感染提供新的思路。

5.細菌分泌酶使抗菌藥物失去活性：目前發現β-內酰胺酶由Hp等分泌，可使β-內酰胺類抗菌藥物(如阿莫西林)失活，這種酶能特異性打開β-內酰胺環，使阿莫西林失去其抗菌活性從而增加耐藥性[42]。而Hp是否亦分泌其他酶以抵抗藥物的滅菌作用仍待進一步研究。

6.毒力因子的參與：在Hp感染過程中，有多種毒力因子參與其中，如細胞毒素相關蛋白A(cytotoxin associated protein A,CagA)、空泡細胞毒素A(vacuolating cytotoxin A,VacA)等。通常認為細菌分泌毒力因子與其致病性密切相關。而有研究[43]顯示，CagA+菌株對抗菌藥物的敏感性較CagA-菌株更強，提示毒力因子亦參與Hp抗菌藥物的耐藥過程，且毒力較弱的菌株較毒力較強的菌株能夠更好地逃避抗菌藥物活性。Hussein等[44]亦發現毒力因子十二指腸潰瘍促進因子A(dupA)與A2147G克拉霉素耐藥有顯著相關性。對細菌分泌的毒力因子與Hp耐藥機制之間的相關性研究有望為Hp的根除治療打開一個新領域。

二、結語和展望

目前，雖然益生菌、中藥、抗菌肽等新的治療手段層出不窮，帶有抗菌藥物的三聯或四聯療法仍是未來一段時間內根除Hp的主要手段，但關于Hp耐藥機制的研究仍不夠完善。因此，致力于尋找和剖析Hp對抗菌藥物耐藥的深層機制以改變Hp耐藥率在國內顯著增長的嚴峻現狀顯得尤為重要。本文從病原體的角度闡述了目前Hp抗菌藥物耐藥的主要分子機制，旨在為進一步降低Hp對抗菌藥物的耐藥率提供新的理論基礎和思路。