超聲造影參數在甲狀腺癌診斷中的應用價值及與病灶組織中癌細胞惡性生物學特征的相關性

葛建麗 劉敏潔 徐更田 趙 曉 何好超

甲狀腺癌為臨床常見惡性腫瘤，發生率約占全身惡性腫瘤的1%。超聲為篩查最常見方式，常規二維超聲檢查能夠有效檢出甲狀腺結節，但對結節性質的評估價值有限[1-2]。超聲造影作為新興定量超聲檢查技術，可實施評估目標組織器官血流情況，并判斷其功能狀態及性質，明顯提高超聲診斷的分辨力、敏感性和特異性[3]。相關研究指出，近年來超聲造影發展迅速，可評價腫瘤內微血管灌注情況，超聲造影定量參數可用于腫塊良惡性鑒別，在甲狀腺良惡性結節鑒別方面的應用逐漸增加[4]。此外，有研究指出，明確惡性腫瘤惡性生物學行為有助于開展針對性干預措施，從而改善患者預后[5]。基于此，本研究在探究超聲造影參數對甲狀腺癌的診斷價值基礎上，進一步研究其與病灶組織惡性生物學行為的內在聯系，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年8月至2019年7月我院117例接受超聲造影檢查的甲狀腺結節患者，根據細針穿刺活檢結果判斷結節良惡性，其中良性76例作為對照組，惡性41例作為研究組。對比2組一般資料，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組一般資料對比

1.2 選例標準

納入標準：①均行超聲造影檢查；②無超聲造影檢查禁忌；③均經細針穿刺活檢確診；④無甲狀腺手術史；⑤既往未接受相關治療；⑥患者及家屬知曉本研究，已簽署同意書。

排除標準：①合并其他惡性腫瘤者；②精神疾病患者；③伴有全身感染性疾病者；④嚴重心腦血管疾病患者；⑤肺結核、乙肝等傳染性疾病患者；⑥血液系統疾病患者；⑦肝腎功能嚴重障礙者；⑧妊娠或哺乳期女性；⑨不能配合完成研究者。

1.3 方法

超聲造影檢查：采用美國GE公司生產的Voluson E8超聲儀，探頭頻率5.0～12.0 MHz。患者平躺，首先對頸部、甲狀腺及其周圍行二維超聲檢查，從縱橫斜多切面掃查，觀察并記錄結節位置、大小、邊界等基本情況，作出超聲造影檢查前初步診斷，切換至超聲造影模式。采用注射器抽取2 ml超聲造影劑，經肘部淺靜脈快速推注，隨后采用5 ml生理鹽水沖管。檢查時探頭及患者應保持不動，持續觀察3 min以上。選取感興趣區域并采用軟件獲取時間-強度曲線，定量分析并獲取超聲造影參數，包括曲線下面積(area under the curve，AUC)、達峰時間(time to peak，TTP)、平均通過時間(mean transit time，MTT)、峰值強度(Peak)。

癌細胞惡性生物學特征檢查：經細針穿刺采集所有患者治療組織標本，采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法檢測目標基因表達量，首先采用磷酸緩沖鹽溶液清洗標本組織，然后行組織碾磨、細胞裂解、總RNA沉淀、清洗干燥、RNA純度測定、樣品cDNA合成、目標基因合成。目標基因包括血管新生基因表達量[血管內皮生長因子(vascular epithelial growth factor，VEGF)、中樞性黏液表皮樣瘤(central mucoepidermoid tumor，c-met)、缺氧誘導因子α(hypoxia inducible factorα，HIF-α)]，侵襲基因表達量[趨化因子受體4(chemokine receptor 4，CXCR4)、特異結合蛋白1(special AT rich sequence binding protein 1，SATB1)、金屬蛋白酶解離素9(A disintegrin and metalloproteinase 9，ADAM9)]，增殖基因表達量[蛋白磷酸酶4調節亞基1(protein phosphatase 4 regulates subunit 1，PP4R1)、靶向Xklp2靶蛋白(Targeting protein for Xklp2，TPX2)、線粒體促凋亡蛋白(second mitochondria-derived activator of caspase，Smac)]及自噬基因表達量[Beclin1蛋白(Beclin1)、磷酸酶張力蛋白樣同源物(tension protein analogue，PTEN)、小ras同源蛋白Ⅰ(A ras homologue member Ⅰ，ARHⅠ)]，應用公式2-ΔΔct進行定量分析。

1.4 觀察指標

(1)2組超聲造影參數(AUC、TTP、Peak、MTT)。(2)探究AUC、TTP、Peak、MTT對甲狀腺癌的診斷價值。(3)2組病灶組織中血管新生基因表達量(VEGF、c-met、HIF-α)。(4)2組病灶組織中增殖基因表達量(PP4R1、TPX2、Smac)。(5)2組病灶組織中侵襲基因表達量(CXCR4、SATB1、ADAM9)。(6)2組病灶組織中自噬基因表達量(Beclin1、PTEN、ARHI)。(7)探究超聲造影參數與病灶組織中血管新生、增殖、侵襲及自噬基因表達的相關性。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 2組超聲造影參數

研究組AUC、TTP、Peak、MTT均較對照組低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組超聲造影參數對比

2.2 ROC分析超聲造影參數對甲狀腺癌的診斷價值

分別繪制AUC、TTP、Peak、MTT單一、聯合診斷甲狀腺癌的ROC曲線，顯示各指標聯合診斷甲狀腺癌的AUC為0.894(95%CI為0.823～0.943)，高于AUC、TTP、Peak、MTT單一預測的AUC 0.792(95%CI為0.707～0.862)、0.814(95%CI為0.732～0.880)、0.803(95%CI為0.720～0.871)、0.788(95%CI為0.702～0.858)，聯合診斷甲狀腺癌的最佳敏感度為80.49%，特異度為85.53%。見圖1。

圖1 ROC分析單一及聯合超聲造影參數對甲狀腺癌的診斷價值

2.3 2組病灶組織中血管新生基因表達量

研究組VEGF、c-met、HIF-α基因表達量均較對照組高，差異有統計學意義(P<0.05)；研究組PP4R1、Smac基因表達量較對照組低，TPX2基因表達量較對照組高，差異有統計學意義(P<0.05)；研究組CXCR4、SATB1、ADAM9基因表達量較對照組高，差異有統計學意義(P<0.05)；研究組Beclin1、PTEN、ARHⅠ基因表達量較對照組低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組病灶組織中血管新生基因表達量對比

2.4 超聲造影參數與病灶組織中血管新生、增殖、侵襲及自噬基因表達的相關性分析

超聲造影參數AUC、TTP、Peak、MTT與病灶組織中癌細胞惡性生物學特征標志物VEGF、c-met、HIF-α、TPX2、CXCR4、SATB1、ADAM9基因表達量呈負相關關系，與PP4R1、Smac、Beclin1、PTEN、ARHⅠ基因表達量呈正相關關系(P<0.05)。見表4。

表4 超聲造影參數與病灶組織中血管新生、增殖、侵襲及自噬基因表達的相關性分析

3 討論

3.1 研究背景

目前，細針穿刺活檢為臨床鑒別甲狀腺結節良惡性的“金標準”，但屬于有創檢查，臨床應用具有一定局限性[6]。二維超聲是篩查甲狀腺結節的首選影像學方法，可清晰反映甲狀腺結節數量、位置、與周邊組織的關系等，但部分惡性結節超聲表現復雜，存在一定的交叉、重疊，致使二維超聲在具體結節良惡性鑒別中存在一定局限性，因此漏診、誤診率較高[7]。近年來，超聲造影技術得到長足進步，在甲狀腺結節良惡性鑒別中的作用越來越受臨床重視。

3.2 超聲造影鑒別甲狀腺結節良惡性的價值

超聲造影是利用造影劑反映、觀察組織的血流灌注情況的技術方法，通過導管將造影劑注入淺靜脈，根據惡性腫瘤內部血供豐富的特征，造影劑流經病灶血管可發生參數水平異常，不同性質的腫瘤時間-強度曲線存在顯著差異，這是超聲造影技術鑒別腫塊良惡性的主要機制[8]。汪彩英等[9]研究選取178例甲狀腺結節患者作為研究對象，經超聲造影檢查發現甲狀腺癌組患者的超聲造影參數AUC、Peak水平低于甲狀腺良性結節組。蒙秋鳳[10]通過對218例接受甲狀腺結節切除術的患者的研究，也發現超聲造影在甲狀腺良惡性鑒別方面具有良好效果，甲狀腺癌組患者TTP、MTT水平低于甲狀腺腺瘤組患者。本研究結果中，惡性甲狀腺結節患者的超聲造影參數AUC、TTP、Peak、MTT均顯著低于良性甲狀腺結節患者，與上述研究結果一致，分析其原因在于：惡性甲狀腺結節內新血管多，且通透性高、排列雜亂，造影劑流過時阻力較大，直接導致超聲造影參數降低[11]。且本研究進一步通過ROC曲線分析發現，AUC、TTP、Peak、MTT在甲狀腺癌診斷方面均具有較高應用價值，尤其是各參數聯合診斷，AUC高達0.894，大于超聲造影各參數單一診斷，聯合診斷的最佳敏感度為80.49%，特異度為85.53%，診斷效能得到良好改善，有助于甲狀腺癌患者的早期診斷及治療，應用價值非常高。

3.3 超聲造影參數與惡性結節惡性生物學特征的關系

近年來大量研究指出，病灶內新血管生成是惡性腫瘤增殖的基礎[12-13]。VEGF作為促進血管新生的主要因子，參與腫瘤血管生成的特異性非常高，且作用強，被認為是惡性腫瘤“血管生成開關”[14]。c-met是一種膜受體，能識別肝細胞生長因子并與之結合，發揮促進血管新生的作用[15]。HIF-α是乏氧相關轉錄因子，在調節腫瘤細胞對缺氧環境適應性方面具有重要作用，其表達增加可促進腫瘤增殖，也可反映腫瘤內部微血管密度[16]。SATB1是調節眾多腫瘤細胞侵襲轉移的基因，具有上調金屬蛋白酶表達、促進炎性因子表達的作用，同時能刺激PI3K/Akt信號通路激活，增強腫瘤細胞的遷移侵襲能力[17]。CXCR4由骨髓基質細胞及相關間皮細胞分泌，與特異性配體結合后可直接參與腫瘤細胞的增殖、浸潤、轉移，李魯申[18]、李劍[19]研究均證實其在惡性腫瘤中呈異常高表達狀態。ADAM9是一種金屬蛋白酶解離素，可降解細胞基質，促進細胞接觸，具有促進腫瘤細胞侵襲轉移的作用[20]。PP4R1參與DNA修復、細胞應激等多種重要的細胞進程，其表達降低可激活IκB激酶，并促進腫瘤細胞增殖[21]。Smac為促凋亡因子，可解除凋亡抑制蛋白對caspase-3、7、9等的抑制作用，從而抑制腫瘤細胞增殖[22]。楊忠信等[23]報道指出，TPX2在紡錘體組裝及形成過程中發揮重要作用，TPX2異常高表達可促進腫瘤細胞染色體基因異常、擴增等。本次研究發現，惡性甲狀腺結節患者VEGF、c-met、HIF-α、CXCR4、SATB1、ADAM9及TPX2基因表達量均高于良性結節患者，PP4R1、Smac基因表達量低于良性結節患者，提示惡性甲狀腺結節內存在血管新生旺盛，腫瘤細胞的侵襲、增殖能力高。進一步經相關性分析發現，惡性甲狀腺結節患者超聲造影參數與病灶組織中VEGF、c-met、HIF-α、TPX2、CXCR4、SATB1、ADAM9基因表達量呈負相關，與PP4R1、Smac基因表達量呈正相關，提示超聲造影參數不僅能鑒別甲狀腺腫瘤良惡性，同時有助于評估腫瘤內血管新生、侵襲和增殖能力。有報道指出，腫瘤細胞的自噬作用是其能動過程，是通過自噬泡內溶酶體溶解變性、壞死細胞器的過程，自噬過程發生異常是導致腫瘤發生的主要因素之一[24]。Beclin1是近年來新發現的抑癌基因，其表達增加可發揮促進癌細胞凋亡及去分化作用，且能加速腫瘤細胞自噬，調節其他蛋白定位至自噬前體，促進自噬體的形成[25]。PTEN、ARHⅠ均為臨床常見抑癌基因，PTEN具有雙特異磷酸酶活性，主要通過促進自噬體形成發揮抑制腫瘤發生發展的作用，ARHⅠ在惡性腫瘤細胞內的表達較低或缺失能導致自噬過程受阻[26]。本研究發現，惡性甲狀腺結節患者的Beclin1、PTEN、ARHⅠ基因表達量顯著降低，且與甲狀腺癌患者超聲造影參數呈正相關關系，充分表明惡性甲狀腺結節內存在自噬障礙，通過超聲造影檢查可在一定程度上反映出自噬障礙程度。

綜上可知，超聲造影參數在甲狀腺癌診斷中具有較高應用價值，且能指導臨床評估癌細胞惡性生物學特征，具有較高臨床應用價值。