卵巢癌組織中SSBP1的表達(dá)意義及作用

苗 麗 王 棟 馬 莉 康安靜 張 潔

卵巢癌(ovarian cancer)是嚴(yán)重威脅女性健康的常見惡性腫瘤之一，與其他婦科腫瘤相比，卵巢癌死亡率最高，術(shù)后晚期患者的五年生存率不足30%[1]。近年來靶向藥物的應(yīng)用為腫瘤治療提供了新思路。

Warburg 效應(yīng)在腫瘤發(fā)生及進(jìn)展中具有關(guān)鍵作用，其調(diào)控機(jī)制研究一直是腫瘤領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題[2]。Warburg效應(yīng)重要特點(diǎn)就是線粒體氧化磷酸化減弱及糖酵解顯著增強(qiáng)。作為真核細(xì)胞中唯一具有獨(dú)立基因組的細(xì)胞器，線粒體在能量代謝、鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、活性氧產(chǎn)生和凋亡調(diào)控等細(xì)胞生理過程中發(fā)揮著重要作用。線粒體數(shù)量和功能異常參與了包括腫瘤在內(nèi)的多種人類疾病的發(fā)生與進(jìn)展。例如研究表明，線粒體DNA拷貝數(shù)異常與肝癌、結(jié)直腸癌和膠質(zhì)瘤等腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和生存顯著相關(guān)[3-4]。但關(guān)于腫瘤中線粒體DNA復(fù)制及線粒體拷貝數(shù)增加的具體誘因及機(jī)制尚不明確。線粒體單聯(lián)DNA結(jié)合蛋白(SSBP1，又稱mtSSB)具有促進(jìn)線粒體DNA復(fù)制和損傷修復(fù)進(jìn)而調(diào)控線粒體生成的重要作用[5]。近年來，SSBP1在腫瘤中作用受到越來越多的關(guān)注。本研究通過從SSBP1在卵巢癌組織中的表達(dá)變化入手，通過從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中選取正常卵巢及卵巢癌組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用Kaplan-Meier模型分析SSBP1與患者生存情況，并進(jìn)一步研究SSBP1對(duì)卵巢細(xì)胞惡增殖的影響，以期為闡明SSBP1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供思路和線索。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//tcgadata.nci.nih.gov/tcga/)下載正常卵巢組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)97例以及有預(yù)后信息的373例卵巢癌數(shù)據(jù)集(年齡30～87歲，中位年齡59歲)；并利用Bioconductor/TCGAbiolinks 函數(shù)包提取mRNA表達(dá)RNASEqV2數(shù)據(jù)。基因的表達(dá)量由Fregments Per Kilobase per Million(FPKM)表示。計(jì)算方法為FPKM=106×nf/L/N。nf是比對(duì)至目標(biāo)基因的片段(fragment)數(shù)量、L是目標(biāo)基因的外顯子長(zhǎng)度之和除以1000(L單位為kb)、N 是總有效比對(duì)至基因組的讀取次數(shù)(read數(shù)量)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3購(gòu)于ATCC細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞采用含10%胎牛血清(四季青生物)的RPMI-1640培養(yǎng)基(上海生工生物)培養(yǎng)，培養(yǎng)箱含5%濃度的CO2，溫度設(shè)定為37 ℃。

取對(duì)數(shù)期卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3，胰蛋白酶消化后用無雙抗 10﹪血清培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種到35 mm培養(yǎng)皿并培養(yǎng)至70%匯合率，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取出培養(yǎng)皿，吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，并每皿加入DMEM培養(yǎng)液約0.5 ml重復(fù)沖洗細(xì)胞兩遍，而后每皿加入 DMEM 培養(yǎng)液1.5 ml，轉(zhuǎn)染復(fù)合物混合液0.5 ml。 輕輕混勻，放入37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)6 h左右后更換培養(yǎng)基。用G418篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。

1.3 Western Blot

首先，用RIPA蛋白裂解液裂解卵巢癌細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，BAC法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定后加入2×上樣緩沖液并置于沸水中煮沸5 min。隨后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并用濕轉(zhuǎn)法將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，分別加入用封閉液稀釋過的SSBP1與actin抗體于4 ℃反應(yīng)過夜，TPBS洗膜3次后加入二抗并在室溫下繼續(xù)反應(yīng)1.5 h，繼續(xù)用TPBS洗膜3次后用化學(xué)發(fā)光法對(duì)最終條帶進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 線粒體定量

去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入配制好的并37 ℃預(yù)溫育的Mito-Tracker Red染色工作液，與細(xì)胞37 ℃共孵育15 min。 去除Mito-Tracker Red染色工作液，加入37 ℃預(yù)溫育的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液。隨后通常用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察分析。

1.5 乳酸及氧氣消耗定量

依照索萊寶乳酸定量試劑盒(貨號(hào)：BC2235)方法：收集5×106個(gè)細(xì)胞加入1 ml提取液，冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300 w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3 min)，隨后4 ℃條件下12 000 g離心10 min取上清應(yīng)用試劑盒測(cè)定。細(xì)胞氧耗檢測(cè)采用氧電極法(Strathkelvin)，信號(hào)采集間隔時(shí)間為0.5秒。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。生存分析采用Kaplan-Meier法。為了選擇最佳FPKM截?cái)嘀?Best FPKM cut-offs)對(duì)患者進(jìn)行最顯著分組，本研究使用所有處于20～80%的FPKM值對(duì)患者進(jìn)行分組，檢查各組生存率的差異，并選擇產(chǎn)生最低log-rankP值的分組方式。利用Person函數(shù)對(duì)兩個(gè)變量之間的相關(guān)性開展分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SSBP1在卵巢癌中的表達(dá)

TCGA數(shù)據(jù)集中正常卵巢組織中SSBP1的表達(dá)量最高為33.8 FPKM，最低為18.4 FPKM，平均數(shù)為26.5 FPKM。而在卵巢癌組織中SSBP1的表達(dá)量最高為58.2 FPKM，最低為5.3 FPKM，平均數(shù)為17.5 FPKM。統(tǒng)計(jì)分析可見，腫瘤組織中SSBP1表達(dá)水平顯著低于正常卵巢組織(P<0.001)，見圖1。

圖1 SSBP1在正常卵巢組織及卵巢癌組織中的表達(dá)分析

2.2 SSBP1表達(dá)水平與卵巢癌患者預(yù)后

利用373卵巢癌患者的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及預(yù)后數(shù)據(jù)的進(jìn)行Kaplan-Meier Plotter生存分析得出，低表達(dá)SSBP1患者的預(yù)后顯著差于高表達(dá)患者(P<0.05，圖2)。進(jìn)而提示，腫瘤組織中高水平的SSBP1是預(yù)后良好因素，低表達(dá)或不表達(dá)與患者生存期縮短顯著相關(guān)。

圖2 SSBP1表達(dá)水平與卵巢癌患者預(yù)后

2.3 SSBP1過表達(dá)對(duì)細(xì)胞糖代謝能力的影響

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌細(xì)胞SKOV-3中穩(wěn)定過表達(dá)SSBP1(圖3A)可顯著增加線粒體含量及細(xì)胞氧耗速率(圖3B和3C)，抑制糖酵解(3D),提示卵巢癌細(xì)胞中SSBP1的降低可促進(jìn)糖酵解、抑制線粒體氧化磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)Warburg效應(yīng)。

圖3 SSBP1過表達(dá)對(duì)細(xì)胞糖代謝能力的影響

2.4 SSBP1過表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

如圖4所示，過表達(dá)SSBP1可顯著抑制結(jié)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，提示腫瘤內(nèi)低表達(dá)SSBP1與較較差預(yù)后可能存在因果關(guān)系。

圖4 SSBP1過表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

3 討論

mtSSBP1在線粒體DNA(mtDNA)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及修復(fù)過程發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，mtSSBP1突變或表達(dá)失調(diào)將導(dǎo)致mtDNA發(fā)生基因突變，最終可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。在本研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)了SSBP1在卵巢癌組織中的表達(dá)顯著低于正常卵巢組織，且腫瘤組織中低表達(dá)SSBP1的患者預(yù)后顯著差與高表達(dá)組患者。與之類似，Li等發(fā)現(xiàn)SSBP1基因多態(tài)性(rs6976500G)可顯著降低SSBP1的轉(zhuǎn)錄活性及表達(dá)水平，進(jìn)而與胃癌的不良預(yù)后顯著相關(guān)[6]。進(jìn)一步Jiang等研究發(fā)現(xiàn)，三陰性乳腺癌組織中SSBP1的表達(dá)下調(diào)可通過“線粒體-核交互信號(hào)通路”激活上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)過程，繼而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[7]。Wang等發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中SSBP1表達(dá)下降、mtDNA拷貝數(shù)降低，并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的放療敏感性升高[5]。此外，Ye等還利用蛋白質(zhì)印跡及免疫組化等方法對(duì)20例肝癌組織的進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，SSBP1在腫瘤組織中表達(dá)異常上調(diào)，推測(cè)可能是由于mtSSBP1蛋白不能正確折疊而導(dǎo)致其在細(xì)胞中的異常累積，并可能造成了mtDNA的復(fù)制障礙及突變[8]。以上研究結(jié)果都提示SSBP1的表達(dá)異常可通過抑制mtDNA復(fù)制及線粒體正常功能，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生進(jìn)展。

正常細(xì)胞通過線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生ATP 提供能量，而腫瘤細(xì)胞則表現(xiàn)出了不同的能量代謝方式。因此，糖代謝重編程是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要特征，其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展互為因果。早在上個(gè)世紀(jì)，德國(guó)生理學(xué)家Otto.Warburg就提出了著名的Warburg效應(yīng)：相比于正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞糖酵解顯著增強(qiáng)，線粒體氧化磷酸化降低來滿足快速生長(zhǎng)的需求[9]。在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，科研工作者一直認(rèn)為腫瘤細(xì)胞有氧呼吸存在不同程度的損傷，即線粒體功能的不可逆性損傷是所有腫瘤的共同起因。然而，進(jìn)來越來越多的研究表明絕大部分腫瘤細(xì)胞中線粒體數(shù)目下降。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)SSBP1的表達(dá)下調(diào)可減少線粒體數(shù)目，并促使卵巢癌細(xì)胞糖酵解與增殖能力的增強(qiáng)。與之相類似，Huang等發(fā)現(xiàn)肝癌中高表達(dá)的CD147分子可通過抑制p53通路下調(diào)線粒體生物生成的關(guān)鍵調(diào)控分子PGC-1α、TFAM等進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞線粒體數(shù)目減少，與腫瘤細(xì)胞的增殖[10]。

上述研究結(jié)果提示，線粒體數(shù)目有望成為1種新型標(biāo)志物用于卵巢癌患者預(yù)后評(píng)估及藥物治療靶點(diǎn)。