CPT1A在能量應激時卵巢癌細胞生存中的調(diào)控作用

鄧 潔 羅劍波 彭 聰 鄧曉楊

腫瘤研究領域內(nèi)的著名學者Hanahan于2011年在Cell雜志撰寫綜述，對腫瘤細胞的十項最主要特征進行了總結(jié)，其中包括腫瘤細胞代謝的異常改變，即代謝重編程[1]。大量研究證實，代謝重編程與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展高度相關[2-3]。由于腫瘤在快速分裂增殖時，新生血管往往相對滯后，當腫瘤體積不斷增大時內(nèi)部常出現(xiàn)營養(yǎng)缺乏的慢性微環(huán)境，腫瘤細胞在營養(yǎng)缺乏環(huán)境中存活的機制一直是腫瘤代謝研究領域的熱點問題[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)缺乏首先會促進腫瘤細胞產(chǎn)生能量應激，此時腫瘤細胞通過使原有代謝特征發(fā)生轉(zhuǎn)變，由非能量應激狀態(tài)時的合成代謝轉(zhuǎn)變?yōu)槟芰繎r的分解代謝，通過分解細胞內(nèi)糖類、脂類、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，對營養(yǎng)缺乏時的能量危機做出適應性反應[5-6]。

人肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1A(carnitine palmitoyltransferase 1A,CPT1A)是定位于線粒體內(nèi)膜參與脂肪酸氧化調(diào)控的關鍵酶，它負責將細胞漿中的脂肪酸轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)進行后續(xù)的脂肪酸氧化[7]。然而目前，作為參與脂肪酸氧化調(diào)控的重要酶，CPT1A在能量應激時腫瘤細胞存活中的作用卻尚不清楚。本項目將首次分析CPT1A在卵巢癌細胞能量應激時的表達變化及其在細胞生存中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人卵巢癌細胞SKOV3購于ATCC細胞庫，細胞采用含10%胎牛血清(四季青生物)的RPMI-1640培養(yǎng)基(上海生工生物)培養(yǎng)，培養(yǎng)箱含5% 濃度的CO2，溫度設定為37 ℃。

細胞能量應激建模方法：采用HBSS平衡鹽溶液饑餓法作為能量應激建模策略。首先，棄去細胞中RPMI-1640培養(yǎng)液，用商品化的HBSS平衡鹽溶液(Thermo Fisher公司，貨號14025076)將細胞洗滌2次后加入HBSS繼續(xù)培養(yǎng)3 h或6 h。

1.2 實驗步驟與方法

1.2.1 qRT-PCR 首先，用商品化的RNA提取試劑盒(OMEGA公司，貨號R6688)提取細胞中總RNA。之后，將所提RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA公司，貨號RR037A)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。目的基因CPT1A與內(nèi)參基因GAPDH的PCR引物由華大基因合成，CPT1A引物序列為：上游5'-ATGCGCTACTCCCTGAAAGTG-3'，下游5'-GTGGCACGACTCATCTTGC-3'。GAPDH序列為：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3，5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。最后，采用2-△△Ct法對各組細胞中CPT1A相對表達水平進行計算。

1.2.2 Western Blot 首先，用RIPA蛋白裂解液裂解卵巢癌細胞并提取細胞總蛋白，BAC法對蛋白濃度進行測定后加入2×上樣緩沖液并置于沸水中煮沸5 min。隨后，用加樣器將各組細胞蛋白加入聚丙烯酰胺凝膠各孔中并進行電泳。第一階段電泳采用90 V恒壓，待樣品進入分離膠后將電壓增大至120 V，溴酚藍被電泳至凝膠底部時即可停止電泳。隨后用濕轉(zhuǎn)法將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，分別加入用封閉液稀釋過的CTP1A與GAPDH抗體于4 ℃反應過夜，TPBS洗膜3次后加入二抗并在室溫下繼續(xù)反應1.5 h，繼續(xù)用TPBS洗膜3次后用化學發(fā)光法對最終條帶進行檢測。

1.2.3 siRNA轉(zhuǎn)染細胞 首先，合成靶向CPT1A的RNA干擾片段與無關對照片段(Qiagen公司)。siRNA轉(zhuǎn)染步驟為：首先，于轉(zhuǎn)染前一日將細胞以1.5×105個/孔的密度接種至6孔板中，采用脂質(zhì)體lip2000作為介質(zhì)進行轉(zhuǎn)染。隨后，用無血清培養(yǎng)基分別稀釋siRNA片段與lip2000，放置5 min后將兩種稀釋液混和，混合液放置25 min后即可加入6孔板中(每孔100 μl)，細胞置于孵箱中培養(yǎng)6 h后即可更換含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 首先，按上步所述方法對卵巢癌細胞中CPT1A表達進行干涉處理，用胰蛋白酶消化并離心收集細胞，PBS洗滌兩次后按試劑盒操作說明(US Everbright lnc 公司，貨號Y6026)對各組卵巢癌細胞進行Annexin V與PI染色，染色結(jié)束后即可上流式細胞儀進行各組細胞的凋亡分析。

1.2.5 細胞氧耗速率分析 首先，按上步所述方法對卵巢癌細胞中CPT1A表達干涉，用胰蛋白酶消化并離心收集細胞。細胞氧耗速率分析采用液相氧電極(英國漢莎公司)。首先，對陽極與陰極電極進行認真清洗，清洗過后按先陽性后陰性的順序依次連接電極，連接完畢后打開電腦軟件并對電極進行校正，隨后建立“零氧線”并依次加入各組細胞并進行氧耗速率測定。

1.2.6 胞內(nèi)ATP檢測 首先，按上步所述方法對卵巢癌細胞中CPT1A表達干涉，用胰蛋白酶消化并離心收集細胞，隨后用ATP檢測試劑盒(碧云天生物公司，貨號S0026)中提供的ATP檢測裂解液對細胞進行裂解并將裂解液于4 ℃條件下12 000 g離心5 min。最后，按試劑盒操作說明對各組細胞中ATP進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行分析，采用單因素方差分析對2組間差異進行分析，P<0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 能量應激可誘導卵巢癌細胞中CPT1A表達上調(diào)

分別對卵巢癌細胞SKOV3進行HBSS培養(yǎng)3 h與6 h，利用qRT-PCR與western blot方法檢測CPT1A表達后發(fā)現(xiàn)(圖1)：HBSS饑餓處理后，SKOV3細胞中CPT1A表達在mRNA與蛋白水平均顯著升高；隨HBSS饑餓處理時間由3 h延長到6 h，CPT1A表達呈逐步升高趨勢。表明能量應激可上調(diào)CPT1A表達，且呈時間依賴效應。

注：A:qRT-PCR實驗分析；B:Western Blot實驗分析。圖1 能量應激(HBSS處理)對卵巢癌細胞中CPT1A表達的影響

2.2 下調(diào)CPT1A可加重饑餓誘導的細胞凋亡

為研究CPT1A在能量應激時卵巢癌細胞生存中的調(diào)控作用，我們首先合成了靶向CPT1A的siRNA干涉片段(si-CPT1A)，將其轉(zhuǎn)染SKOV3細胞并利用qRT-PCR與western blot對干涉效率進行檢測后發(fā)現(xiàn)(圖2A與2B)：我們合成的siRNA可顯著下調(diào)SKOV3細胞中CPT1A表達。

注：A:qRT-PCR實驗分析；B:Western Blot實驗分析。圖2 siRNA下調(diào)卵巢癌SKOV3中CPT1A表達的效率分析

隨后，我們利用流式細胞術，分析了下調(diào)CPT1A對饑餓處理時卵巢癌細胞存活的影響，結(jié)果如圖3所示：用siRNA下調(diào)CPT1A表達后，饑餓誘導的卵巢癌細胞凋亡被顯著增強，表明CPT1A具有抑制能量應激時卵巢癌細胞凋亡的作用。

注：A為典型凋亡檢測結(jié)果；B為統(tǒng)計分析結(jié)果。圖3 流式細胞術分析下調(diào)CPT1A對卵巢癌細胞凋亡的影響

2.3 下調(diào)CPT1A可降低饑餓時卵巢癌細胞的氧耗與ATP生成

為初步探討CPT1A是否通過增強脂肪酸氧化與能量ATP產(chǎn)生，進而發(fā)揮保護能量應激時卵巢癌細胞凋亡，我們進一步分析了下調(diào)CPT1A表達對能量應激時卵巢癌細胞氧氣消耗速率與能量ATP產(chǎn)生的影響，結(jié)果如圖4與圖5所示：用siRNA下調(diào)CPT1A表達后，能量應激時卵巢癌細胞的氧氣消耗速率與能量ATP產(chǎn)生均顯著降低，提示下調(diào)CPT1A可能通過抑制脂肪酸氧化而加重饑餓時細胞的凋亡。

圖4 下調(diào)CPT1A對能量應激時卵巢癌細胞氧耗速率的影響

圖5 下調(diào)CPT1A對能量應激時卵巢癌細胞ATP生成的影響

3 討論

代謝重編程是腫瘤細胞新的十大特征之一，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關鍵作用，促進代謝重編程發(fā)生的分子機制是目前腫瘤研究領域的熱點[8]。腫瘤細胞具有異常快速分裂增殖的特性，而與之相比，腫瘤的血管新生則相對滯后，常導致實體腫瘤內(nèi)部出現(xiàn)慢性營養(yǎng)缺乏微環(huán)境，腫瘤細胞克服營養(yǎng)缺乏微環(huán)境得以存活的機制是該腫瘤代謝領域的重要科學問題之一[4,9]。目前觀點認為，營養(yǎng)缺乏時腫瘤細胞主要通過使原有代謝特征發(fā)生轉(zhuǎn)變，由以合成代謝為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐匝趸纸獯x為主，通過氧化分解胞內(nèi)糖、脂等生物大分子，對營養(yǎng)缺乏做出適應性反應[10]。然而，哪些關鍵代謝酶介導了能量應激時腫瘤細胞代謝重編程并促進細胞存活尚不十分清楚。

CPT1A是參與細胞脂肪酸氧化調(diào)控的關鍵酶，負責將細胞漿中的游離脂肪酸轉(zhuǎn)運至線粒體進行后續(xù)的氧化[7]。近年來，CPT1A被證實與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關。如Wang等研究發(fā)現(xiàn)，CPT1A介導的脂肪酸氧化可促進結(jié)直腸癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力[11]。此外，Xiong等研究證實，CPT1A被證實可通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子VEGF而促進乳腺癌的淋巴管生成[12]。Shi等在急性白血病中研究發(fā)現(xiàn)，CPT1A表達與患者預后顯著相關，高表達患者具有較差的預后[13]。Tan等證實，通過RNA下調(diào)CPT1A可增強鼻咽癌對放療的敏感性[14]。我們研究證實，CPT1A在能量應激時表達顯著上調(diào)，下調(diào)CPT1A可加重饑餓誘導的細胞凋亡，表明CPT1A具有促進能量應激時腫瘤細胞存活的作用。因此，上述研究共同表明，CPT1A是一個重要的促癌基因，不但能在正常情況下促進腫瘤進展，也可在應激條件下促進腫瘤細胞存活。

CPT1A是重要的脂肪酸氧化調(diào)控酶，CPT1A發(fā)揮促能量應激時腫瘤細胞存活是否是通過促進脂肪酸氧化呢？為回答以上問題，我們對兩個最主要的細胞氧化代謝指標(細胞氧氣消耗速率與ATP生成)進行了分析并發(fā)現(xiàn)：下調(diào)CPT1A表達后，能量應激時卵巢癌細胞的氧氣消耗速率與能量ATP產(chǎn)生均顯著降低，表明CPT1A極可能是通過激活脂肪酸氧化而促進能量應激時卵巢癌細胞的存活。與我們結(jié)果類似，Sang-Min等的研究同樣證實，增強的脂肪酸氧化可促進能量應激時腫瘤細胞的存活[15]。該研究發(fā)現(xiàn)能量應激可激活細胞內(nèi)能量感受器AMPK(AMP-activated protein kinase)，后者進一步磷酸化活化參與脂肪酸氧化第一步反應調(diào)控的關鍵酶ACC1(Acetyl-CoA carboxylas 1)活性，進而激活細胞內(nèi)脂肪酸氧化，最終促進了腫瘤細胞的存活。上述結(jié)果共同提示：激活脂肪酸氧化是能量應激時腫瘤細胞存活的重要機制。

本研究首次在卵巢癌證實，能量應激時CPT1A表達顯著上調(diào)，進一步通過促進脂肪酸氧化與ATP生成而促進腫瘤細胞存活。提示CPT1A是治療卵巢癌的潛在分子靶標。