低氧對惡性黑素瘤A375細胞中Nodal及細胞遷移相關蛋白表達的影響

王艷云 高明敏 姚 麗 張永紅

惡性黑色素瘤是黑色素細胞發生的惡性腫瘤，以中老年人為主要發病對象，隨著年齡增加發生率有升高趨勢[1-3]，目前惡性黑色素瘤的治療仍然以外科手術為主，但是術后多需要進行配合化療以延長患者生存率。Nodal是1種胚胎成形素，是轉化因子β超家族成員之一，其與細胞的分化、增殖等有關，而且也與腫瘤發生、血管形成、損傷修復等有關[4-6]。惡性黑色素瘤的生長環境具有低氧的特點，因此，本研究對低氧對惡性黑素瘤A375細胞中Nodal及細胞遷移相關蛋白表達的影響進行了研究，以嘗試分析惡性黑素瘤A375細胞內低氧的環境中Nodal及細胞遷移相關蛋白表達情況，現將相關研究結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

人惡性黑色素瘤細胞株A375細胞來源于北京中科院科研中心，SB-431542及氯化鈷(CoCl2)均來源與美國 Sigma公司，人抗鼠 Vimentin抗體、人抗鼠Nodal抗體、人抗鼠 ALK7抗體均來源于美國 Santa Cruz公司，人抗鼠 MMP2抗體來源于英國 Abcam公司。HRP標記羊抗兔 IgG來源于美國 Bioworld公司，HRP標記羊抗小鼠IgG來源于美國 Bio-world公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養方法及低氧環境的設置 將冷凍儲存的A375細胞復蘇后置于含有10%FBS的完全培養基中進行培養，培養條件：溫度37 ℃，5%CO2，恒溫細胞孵育箱內孵育培養。每間隔24 h換培養液1次，在顯微鏡下觀察到培養的細胞已在培養基內布滿80%面積后加入0.25%胰蛋白酶消化，后在離心機內以3 000 r/min轉速、4 ℃溫度條件下離心，然后按照1∶2進行傳代培養。參考相關文獻的方法[7]，以CoCl2誘導構建A375細胞內的低氧環境。

1.2.2 SB-431542阻斷Nodal信號通路的方法 在A375細胞培養到3～8代對數生長期后對細胞進行SB-431542阻斷，取5 μmol/l、10 μmol/l、20 μmol/l、30 μmol/l、40 μmol/l濃度的SB-431542母液，后在96孔板內每孔接種5×103個細胞后進一步培養12 h，在細胞貼壁后將不同濃度的SB-431542母液分組加入，每組為5個復孔，加入SB-431542母液后溫度37 ℃、5%CO2的條件下進一步孵育培養直至72 h，分別觀察24 h、48 h、72 h時的阻斷結果。

1.2.3 A375細胞增殖的影響檢測方法 以MTT法繼續檢測SB-431542對A375細胞增殖活力的影響，在 SB-431542阻斷A375細胞增殖后，在每孔加入MTT溶液20 μl，加入時避光，然后繼續培養4 h，將培養液吸除后加入150 μl的DMSO，震蕩10 min，將晶體充分溶解，然后用波長為490的酶聯儀對每孔的吸光度值(OD)進行測定。

1.2.4 遷移相關蛋白表達的檢測方法 以Western Blot方法檢測相關蛋白水平。A375細胞放置于6孔板內，每孔A375細胞個數為5×105個，培養之貼壁，吸除培養液，設置空白對照組、CoCl2組、SB-431542阻斷組和CoCl2+SB-431542組，每組為6孔，根據設置條件分別進行相應的干預，以BCA法計算蛋白濃度，然后加入SDS-PAGE電泳及目標蛋白，通過轉 PVDF膜及5%的脫脂牛奶溫室封閉等處理，最后加入目標一抗蛋白，在4 ℃下孵育過夜，隔日進行洗膜后加入目標蛋白二抗然后在25 ℃下孵育1 h 30 min，最后采取ECL法顯影后對目標蛋白表達水平采用Image Lab軟件測定分析表達量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 不同濃度SB-431542在不同時點對A375細胞增殖的阻斷結果

不同濃度的SB-431542阻斷A375細胞Nodal信號通路后細胞形態無明顯改變，以上不同濃度阻斷24 h、48 h、72 h時A375細胞增殖活力比較差異有統計學意義(F=152.39，P<0.05)，隨著時間增加細胞活力明顯增強，但是隨著濃度增加，細胞活力隨之下降，SB-431542對A375細胞增殖的阻斷具有劑量和時間依賴性，見表1。SB-431542濃度為 10 μmol/l阻斷A375細胞后繼續培養48 h時細胞增殖活力低的同時毒性也降低，因此本研究后續相關研究中SB-431542阻斷A375細胞的濃度和時間均選擇此條件下進行相關研究。

表1 不同濃度SB-431542在不同時點對A375細胞Nodal信號通路阻斷結果

2.2 各組不同條件下Nodal及細胞遷移相關蛋白表達

各組Nodal、MMP2、ALK7、Vimentin的表達比較差異有統計學意義(F=44.283、111.481、104.34、92.647，P<0.05)，CoCl2組A375細胞內 Nodal、MMP2、ALK7、Vimentin的表達均較空白對照組上調(t=10.410、21.127、43.274、/10.125，P<0.05)，與CoCl2組比較SB-431542阻斷組、CoCl2+SB-431542組表現為以上蛋白表達下調(SB-431542阻斷組:t=24.374、20.928、40.291、10.765，CoCl2+SB-431542組:t=15.319、7.259、6.306、4.718，P<0.05)，見表2。

表2 各組不同條件下Nodal及細胞遷移相關蛋白相對表達量

3 討論

惡性黑色素瘤的發生發展是1個多因素參與的復雜過程，其機制仍然不是很清楚[8-10]，但是研究顯示，惡性腫瘤的發生及發展與胚胎發育過程有一定的相關性。Nodal作為轉化因子β超家族成員之一，研究顯示Nodal可誘導干細胞的分化及參與到原始胚層的形成等途徑[6]，在胚胎的不同發育時期Nodal信號均對其進行調控，隨著胚胎的發育，除了在胎盤、卵巢上皮、子宮內膜等生殖系統，Nodal作為“胚胎信號”會逐漸關閉，但是有研究發現在子宮內膜癌、膽囊癌、惡性黑色素瘤等惡性腫瘤中也能檢測到Nodal表達通道被再次重啟[11-13]，研究證實在以上惡性腫瘤組織中可檢測到Nodal的表達上調，同時還與腫瘤的侵襲、轉移及預后密切相關。

腫瘤組織內除了腫瘤組織外還有成纖維細胞、免疫細胞及內皮細胞等，共同構成了惡性腫瘤的微環境，但是這種微環境并不是固定不變化的，低氧環境是大多數實體瘤生存不可缺少的條件，大多數的惡性腫瘤在低氧環境中可以生存。MMP2是基質金屬蛋白基因家族成員之一，研究發現與抑制細胞遷移密切相關[14-15]，對腫瘤血管有促進新生血管生成作用。Nodal的信號轉導由位于細胞膜上的Ⅰ型受體(ALKs)和Ⅱ型受體(ActRII)介導，因此ALK7是Nodal信號通路中主要的受體靶點，研究顯示，ALK7的阻斷可阻斷Nodal信號通路[16]。Vimentin屬于Ⅲ型中間絲，中間絲又是細胞結構的主要組成部分，研究顯示[17-18]Vimentin在侵襲性的惡性腫瘤中表達會明顯升高，而且與腫瘤的轉移和預后密切相關，對細胞的凋亡過程也有影響。在惡性黑色素瘤患者的腫瘤組織中，Nodal及其相關蛋白的表達是升高的[19]，以上相關蛋白也與惡性黑色素瘤的轉移及預后密切相關[20-23]。

惡性黑色素瘤普遍分化程度較低，相對于高分化惡性腫瘤，惡性黑色素瘤更容易處于低氧的微環境狀態，因此，本研究對低氧狀態下對惡性黑素瘤A375細胞中Nodal及細胞遷移相關蛋白表達進行了研究，采取CoCl2構建低氧環境模型，以SB-431542作為阻斷Nodal信號通路的阻斷劑，觀察了最終Nodal及細胞遷移相關蛋白表達的變化，結果顯示低氧環境下Nodal及MMP2、ALK7、Vimentin表達均出現上調現象，表明低氧環境可促使惡性黑色素瘤A375細胞中Nodal的誘導進一步表達，而且遷移相關蛋白MMP2、ALK7、Vimentin也可能參與了腫瘤的轉移和擴散。同時，以SB-431542作為阻斷Nodal信號通路的阻斷劑，Nodal信號通路被不同程度阻斷，A375細胞增殖出現不同程度抑制，研究表明，SB-431542可抑制惡性黑色素瘤A375細胞的增殖、侵襲和遷移。分析A375細胞在低氧環境下加入SB-431542，雖然將單純低氧環境時以上蛋白水平表達有所下調，但是相對于未經處理的空白對照組細胞，MMP2、ALK7、Vimentin的表達仍然高于空白對照組細胞，表明低氧環境下的A375細胞即使采取SB-431542阻斷，仍然存在一定程度的增殖、侵襲和遷移能力，低氧是A375細胞增殖、侵襲和遷移的主要條件。

綜上所述，低氧環境可誘導惡性黑色素瘤A375細胞中Nodal及MMP2和Vimentin的表達上調，這可能與A375細胞的遷移和侵襲惡化有關，同時通過SB-431542可阻斷細胞增殖的Nodal信號通路。