大麻二酚對阿霉素心肌毒性的保護作用及機制研究

俞東霞, 吳玉宇

(浙江省青春醫院 心電圖室，浙江 杭州 310020)

阿霉素(doxorubicin，DOX)是目前臨床最常用的廣譜抗腫瘤藥物之一，但其劑量依賴性的心臟毒性副作用限制了臨床應用。阿霉素心臟毒性還可發展至不可逆的心肌病及心力衰竭[1]。阿霉素心臟毒性的具體機制尚未闡明，可能與氧化/硝化應激反應、細胞凋亡機制激活、線粒體功能障礙、繼發炎癥反應等相關[2]。大麻二酚(cannabidiol，CBD)是從大麻中提取的非精神類藥物，體內不激活1型和2型大麻素受體，人體應用安全。研究[2]發現，在結腸炎、缺血再灌注損傷、神經退行性疾病、糖尿病及其并發癥等疾病模型中，大麻二酚具有抗氧化和抗炎作用。在國外，含大麻二酚的藥物已被臨床應用于治療小兒癲癇、多發性硬化所致的疼痛和痙攣[3]。本研究利用小鼠阿霉素心臟毒性模型，在氧化/硝化應激反應、凋亡信號通路等方面探討大麻二酚對阿霉素心臟毒性的保護作用及其機制，以期為阿霉素心臟毒性的防治研究提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料 C57BL/6小鼠購自浙江省醫學科學院實驗動物中心， 6～8周齡，雄性，體質量22～30 g。阿霉素購自Med Chem Express公司，大麻二酚購自Tocris公司，血清肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，抗NAPDH氧化酶(NOX2)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、GAPDH抗體購自Santa Cruz公司，超氧化物岐化酶(SOD)，谷胱甘肽(GSH)，丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術公司，逆轉錄試劑盒購自Roche公司。

1.2 小鼠心肌毒性模型構建 小鼠心肌毒性模型構建[4]：C57BL/6小鼠腹腔單次注射阿霉素(20 mg/kg)，自由進食進水，5 d后麻醉下處死動物獲取所需標本。

1.3 實驗動物分組及給藥 40只C57BL/6小鼠隨機分成4組，每組10只：⑴阿霉素致心臟毒性組(DOX組)：腹腔單次注射阿霉素(20 mg/kg)；⑵CBD干預組(DOX+CBD組)： 腹腔單次注射阿霉素(20 mg/kg)，在注射阿霉素前90 min腹腔注射大麻二酚(10 mg/kg)，次日開始每天腹腔注射大麻二酚(10 mg/kg)1次，注射5 d；⑶大麻二酚對照組(CBD組)：腹腔僅注射大麻二酚，劑量、療程按照DOX+CBD組中CBD使用；⑷陰性對照組(Control組)：僅腹腔注射等量的生理鹽水。藥物干預5 d后麻醉處死小鼠，獲取所需標本進行相應的檢測。

1.4 CK和LDH測定 小鼠處死后留取血液標本，靜置30 min后，3 500 r/min(有效離心半徑8.5 cm)離心5 min后取血清。按照CK和LDH測定試劑盒說明書方法檢測CK和LDH水平。

1.5 心肌組織NOX2、iNOS蛋白印跡測定 取小鼠部分心肌組織加RIPA裂解液在冰上裂解并提取蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取100 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶封閉后，分別加入抗NOX2、iNOS、GAPDH一抗(一抗1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。TBST洗脫后加二抗(二抗1∶2 500稀釋)，孵育1 h，ECL化學顯色發光。

1.6 心肌組織SOD、GSH、MDA水平測定 取小鼠部分心肌組織液氮保存，預冷PBS中勻漿。按照SOD、GSH、MDA檢測試劑盒說明書方法測定心肌組織中SOD、GSH、MDA水平。

1.7 實時熒光定量PCR 取小鼠部分心肌組織研磨，Trizol法提取RNA，逆轉錄為cDNA。構建PCR反應體系，利用Primer-BLAST設計引物，以GAPDH作為內參，采用相對2-△△CT法進行定量分析。引物序列由北京擎科新業生物技術有限公司合成。

1.8 統計學分析 計量資料比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大麻二酚對小鼠CK和LDH水平的影響 DOX組小鼠的血清CK和LDH水平高于陰性對照組和CBD組，CBD+DOX組的CK和LDH水平均低于DOX組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

2.2 大麻二酚對小鼠氧化應激損傷的影響 DOX組的NOX2、iNOS表達均高于陰性對照組和CBD組，CBD+DOX組的NOX2、iNOS表達均低于DOX組，差異均有統計學意義(P<0.05)(圖2A，圖2B，圖2C)；DOX組的MDA水平高于陰性對照組和CBD組(圖2D)，SOD、GSH水平均低于陰性對照組和CBD組(圖2E，圖2F)；CBD+DOX組的MDA水平低于DOX組，CBD+DOX組的SOD、GSH水平均高于DOX組；差異均有統計學意義(P<0.05)。

*與Control、CBD組比較，P<0.05；#與DOX組比較，P<0.05。圖2 大麻二酚對小鼠氧化應激損傷的影響

2.3 大麻二酚對小鼠心肌組織凋亡通路的影響 DOX組小鼠心肌組織的Caspase 3 mRNA、Caspase 8 mRNA、Caspase 9 mRNA水平均高于陰性對照組和CBD組，CBD+DOX組的Caspase 3 mRNA、Caspase 8 mRNA、Caspase 9 mRNA水平均低于DOX組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

*與Control、CBD組比較，P<0.05；#與DOX組比較，P<0.05。圖3 大麻二酚對小鼠心肌組織凋亡通路的影響

2.4 大麻二酚對小鼠TNF-α、IL-1β mRNA水平的影響 DOX組小鼠心肌組織的TNF-α mRNA、IL-1β mRNA水平均高于陰性對照組和CBD組，CBD+DOX組的TNF-α mRNA、IL-1β mRNA水平均低于DOX組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

3 討論

阿霉素引起的心肌病是一個復雜的過程，具體機制目前尚不明確，除營養支持外無有效治療措施。

*與Control、CBD組比較，P<0.05；#與DOX組比較，P<0.05。圖4 大麻二酚對小鼠TNF-α、IL-1β mRNA水平的影響

大麻二酚從大麻中提取，在多種炎性疾病或神經退行性病變模型中被證實具有潛在的抗氧化抗炎作用，且上述作用與經典的G蛋白偶聯受體CB1、CB2無關[5]。

研究[6]發現，腹腔注射阿霉素能顯著提高心肌組織中氧化/硝化應激反應，同時損害體內抗氧化保護機制。NADPH氧化酶(尤其是NOX2)依賴性的氧自由基(ROS)在阿霉素心臟損傷中起重要作用。本研究結果顯示，阿霉素腹腔注射不僅能顯著提高小鼠心肌組織中NOX2水平，同時也增加了iNOS表達，因iNOS產生的NO和超氧陰離子參與過氧亞硝酸鹽的形成，提示iNOS參與了阿霉素致心肌損傷過程。3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine, 3-NT)是過氧亞硝酸鹽形成的標志，廣義上代表了硝化應激的水平。過氧亞硝酸鹽可導致脂質過氧化，MDA是脂質過氧化的終產物之一，是ROS產生的標志。關鍵收縮蛋白、內質網Ca2+通道的硝基化觸發促分裂素原活化蛋白激酶(MARP)的激活，后者活化細胞凋亡通路、影響線粒體功能。上述因素又反過來促使更多活性氧自由基產生，惡性循環不斷加重，最終導致心肌損傷、心臟功能障礙。阿霉素誘導小鼠心肌中NOX2、iNOS表達增高，ROS產生增多，同時損害了體內抗氧化保護機制(減低了GSH和SOD水平)，導致組織氧化/應激損傷，3-NT和MDA升高，最終影響組織器官功能。本研究結果顯示，CBD能下調NADPH氧化酶(NOX2)表達，減少DOX誘導的心肌組織ROS產生；CBD降低DOX誘導的iNOS表達升高，減少了產生過氧化亞硝酸鹽所需的NO；同時CBD通過增加體內氧自由基的清除(增加了GSH和SOD水平)，來緩解DOX引起的小鼠心肌組織中氧化應激損傷(降低了MDA水平)。研究[7]認為，阻斷NADPH氧化酶和iNOS通路在多個模型中起重要作用，如順鉑腎損傷、臟器缺血再灌注損傷等。本研究結果提示上述通路在阿霉素心肌損傷中起重要作用，阻斷上述通路可能減輕其心臟毒性。

阿霉素引起心肌組織中凋亡通路的活化(Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9表達升高)，炎癥反應(TNF-α，IL-1β表達增高)，促進心肌組織損傷。研究[8-9]報道，在糖尿病心肌病、心肌梗死動物模型中，CBD都有降低炎癥反應的作用，而且在大麻素受體2敲除小鼠中，CBD亦有抗氧化應激和抗炎作用，這更證實了CBD并不通過大麻素受體發揮作用。本研究結果顯示，CBD可明顯減低DOX誘導的炎癥因子表達增加，降低相關炎癥反應；另一方面，CBD減輕DOX誘導的心肌組織中凋亡通路的激活，減輕心肌組織損傷。

CBD能減輕DOX心肌毒性作用，但CBD是否影響DOX的抗腫瘤效應目前尚未完全明了。CBD對多個腫瘤細胞系都具有抗腫瘤活性；CBD可抑制基質金屬蛋白酶活性，而基質金屬蛋白酶在腫瘤進展和轉移中起重要作用，提示CBD對抗腫瘤藥物可能是起協同而非拮抗作用[10]，后續還需進一步驗證。

綜上所述，CBD可能通過緩解氧化/硝化應激反應、減輕炎癥反應，下調凋亡通路激活等機制緩解小鼠DOX心臟毒性作用。