miRNA-29c在前列腺癌中的表達及其臨床意義

蔡海榮，王 平，金百冶

(1.浙江大學 醫(yī)學院，浙江 杭州 310002；2.浙江臺州市立醫(yī)院 泌尿外科，浙江 臺州 318000；3.浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 泌尿外科，浙江 杭州 310006)

前列腺癌(prostate cancer，PC)是男性中最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。據美國最新2019年研究調查數據顯示，前列腺癌在美國十大癌癥新發(fā)病率中上升至第1位，其所致死亡數高居美國男性癌癥相關死亡第二位[1]；同樣，前列腺癌在我國的發(fā)病率亦呈逐年上升趨勢。目前臨床主要是通過檢測前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)表達水平來進行篩查和早期診斷，然而PSA作為前列腺癌早期診斷的標志物缺乏敏感性和特異性。因此，積極尋找新的診斷標志物來聯(lián)合PSA作為前列腺癌早期診斷標記，是當前研究的熱點[2]。

MicroRNA(miRNA)是一類調節(jié)蛋白編碼的內源性小分子單鏈RNA,其主要通過與信使RNA的特定序列結合，從而抑制翻譯或剪切RNA轉錄物來對基因進行轉錄后表達的調控[3]。miRNA-29c在許多實體腫瘤如神經膠質瘤、肝細胞癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌中均呈低表達，并且起到抑癌基因作用。然而，miRNA-29c在前列腺癌中的作用和潛在機制尚不明確。本文通過檢測miRNA-29c在前列腺癌患者中的表達量，探討其在前列腺癌中的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象選擇 選取本院泌尿外科2015年1月—2017年1月收治的40例前列腺癌患者，納入標準：①經病理切片證實；②首次診斷。排除標準：①他處具有原發(fā)性腫瘤；②術前具有放化療治療；③不配合實驗者?；颊吣挲g48～82歲，平均(64.5±9.8)歲，其中年齡≥60歲26例，<60歲14例。將腫瘤按2016AJCC TNM分期進行分期：Ⅰ期17例，Ⅱ期7例，Ⅲ期11例，Ⅳ期5例；將前列腺癌按病理Gleason評分分級：高分化腺癌26例(Gleason2～6分)，中分化腺癌8例(Gleason7分)，低分化腺癌6例(Gleason8～10分)。同期選取前列腺增生(BPH)患者30例，平均年齡(61.9±8.44)歲；健康體檢男性30例，平均(42.13±9.22)歲。所有患者疾病確診前后均未進行任何治療。

1.2 主要試劑和儀器 RNA 抽提試劑Trizol 購自Invitrogen 公司，逆轉錄試劑盒、SYBR Premix ExTaq 試劑盒均購自TaKaRa 公司，miRNA-29c、U6逆轉錄引物和PCR上下游引物均由廣州Ribobio生物科技有限公司提供。實時熒光定量 PCR儀器購自美國Bio-Rad有限公司。

1.3 標本收集和處理 收集40例前列腺癌患者血清及其癌和癌旁組織、30例前列腺增生患者血清及30例健康體檢男性血清。前列腺癌患者新鮮靜脈血2 mL，以2 000 r/min在離心機上離心10 min，吸取其上清液移至2 mL離心管中，再以12 000 r/min離心2 min，吸取上層無細胞血清200 μL至2 mL EP中，放置-80℃冰箱中保存待測。用TRIzol試劑盒，根據操作說明提取各血清樣本中的總RNA，并測定總RNA濃度及純度，取吸光度比值為1.8～2.1的樣品用于后續(xù)試驗。前列腺癌及癌旁組織標本直接放入液氮中保存?zhèn)溆茫煌瑯邮褂肨RIzol試劑盒提取癌及癌旁組織標本的總RNA。取 400 ng總RNA，TaKaRa逆轉錄反應試劑盒酶進行逆轉錄反應，反應體系為10 μL，包括 5×PrimeScript Buffer 2 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT Primer(50 μM)0.5 μL，Random 6 mers(100 μM)0.5 μL，補無酶水至10 μL。 反應條件為37℃ 15 min(反轉錄反應)，85℃ 5 s(反轉錄酶的失活反應)，4℃，產物置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 miRNA-29c的表達水平測定 根據TRIzol試劑盒操作說明提取各樣本的總RNA，并測定總RNA濃度；然后依據逆轉錄試劑盒操作說明，以U6作為內參，將樣本分別逆轉錄成為cDNA；再以U6作為內參，SYBR? Premix Ex Taq II聚合酶、miRNA-29c引物和 SYBRGreen熒光染料進行實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)，miRNA-29c引物序列：上游序列5′-UGACCGAUUUCUCCUGGUGUUC-3′,下游序列5′-UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA-3′，其中以 U6 作為內參引物， 其上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。相對表達量計算公式為 RQ=2-△△CT。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對實驗數據進行整理及分析，計量資料2組間比較用t檢驗，多組間比較采用方差分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-29c的表達水平 前列腺癌患者、BPH者和健康體檢者血清中miRNA-29c的表達量分別為(0.357±0.012)、(0.836±0.023)和(0.818±0.015)。前列腺癌患者血清中miRNA-29c的表達水平顯著低于BPH和健康體檢者，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；BPH組和健康對照組血清中的miRNA-29c表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

***：P<0.001圖1 miRNA-29c在前列腺癌(PCA)、良性前列腺增生(BPH)和健康對照(NC)血清中的相對表達量

2.2 血清miRNA-29c表達變化與PC患者臨床病理相關參數的相關性 對前列腺癌患者臨床病理相關參數進行分組(表1)，結果提示：不同Gleason評分、腫瘤分期及是否骨轉移的患者間血清miRNA-29c表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，不同血清前列腺抗原(PSA)水平的患者間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 不同臨床病理參數前列腺癌患者的血清miRNA-29c表達水平比較

2.3 前列腺癌患者癌組織中的miRNA-29c表達水平 RT-PCR檢測結果顯示，miRNA-29c在40例前列腺癌實體腫瘤組織及其癌旁組織中的表達水平分別為(0.86±0.038)、(1.38±0.072)，2者間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 miRNA-29c在前列腺癌及其癌旁組織中的表達水平

3 討論

迄今為止，前列腺癌的發(fā)病機制仍然沒有明確，早期前列腺癌患者接受及時有效的治療后，大部分能得到比較好的恢復，但由于前列腺癌早期無明顯的臨床特征，出現癥狀時，往往已經處于晚期。臨床上對前列腺癌早期篩查主要是通過檢測前列腺特異性抗原(PSA)，且PSA是前列腺癌診斷及預后的常用指標，診斷前列腺癌的PSA標準臨界值為4 ng/L，然而當PSA值為4～10 ng/mL時(即PSA灰區(qū))，前列腺癌的檢出率不超過30%[4]，同時PSA又容易導致對前列腺癌的診斷和治療過度[5]；此外PSA在前列腺增生及前列腺炎患者中有時同樣會出現一定程度的升高，這就使其在臨床上的應用產生局限性。

miRNA是一種內源性非編碼RNA，主要通過特異性結合靶基因mRNA的3′-UTR序列，從而起到調控目的基因的表達及翻譯作用，miRNA參與機體內60%以上的基因調控網絡[6]。作為轉錄后調控序列，miRNA參與機體的各種生理功能，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[7-9]。某些miRNA 表達與多種惡性腫瘤相關，起著抑癌基因及癌基因的作用，有些甚至與惡性腫瘤的診斷預后相關[10-11]。miRNA-29家族包括miR-29a/b/c, miRNA-29c位于第1號染色體，是此家族主要成員，miRNA-29a/b/c只是2個或者3個堿基不同，miRNA-29a和miRNA-29c主要通過RNA誘導沉默復合體(RNA induced silencing complex RISC)機制發(fā)揮作用，miRNA-29b主要通過其他機制調節(jié)靶基因的表達[12]。該家族成員在惡性腫瘤細胞的表達都出現異常且執(zhí)行抗腫瘤的作用，其成員在功能上具有重疊的地方，如轉錄調控、細胞凋亡、表觀遺傳修飾等[13]。雖然成熟的miR-29a/b/c序列高度相同，然而miRNA-29家族中不同亞型各自發(fā)揮其獨特的功能[14]。miRNA-29c在許多實體腫瘤如乳腺癌、肝細胞癌、胃癌、膀胱癌等中均呈低表達，并且起到抑癌基因作用[15-17]。如在三陰性乳腺癌癌前病變中，miRNA-29c及其下游通路起到重要調節(jié)作用[18]；在胃癌中，miRNA-29c可以通過和RCC2靶向結合，降低其表達，從而起到抑制胃癌增殖的能力[19]；在膀胱癌中，miRNA-29c通過調控靶基因CDK6起到抑制其增殖與侵襲的作用[20]；此外，Zhang等[21]研究發(fā)現在結直腸癌中miRNA-29c呈低表達，SPARC被確定為miRNA-29c的直接靶標，其沉默可降低腸癌細胞增殖和遷移。最近研究發(fā)現miRNA-29c通過多途徑對前列腺癌的發(fā)展起抑制作用，如Li等[22]研究發(fā)現上調的miRNA-29c通過抑制前列腺癌中的SLC2A3基因表達來抑制其細胞增殖和糖酵解。

在本研究中，我們發(fā)現miRNA-29c在前列腺癌患者血清中的表達量顯著低于BPH患者和健康對照者，而BPH患者和健康對照者間無顯著性差異。進一步分析發(fā)現Gleason評分≥7分、Ⅲ/Ⅳ期、有骨轉移的前列腺癌患者的miRNA-29c表達量明顯低于<7分、Ⅰ/Ⅱ期、無骨轉移的患者，可見miRNA-29c的表達水平隨著臨床分期的增加而進一步下降，而與血清前列腺抗原(PSA)水平無明顯相關。因此，可以通過檢測血清miRNA-29c的表達水平來區(qū)分前列腺癌患者與健康者，為臨床上對前列腺癌患者的早期診斷提供可靠依據。此外，miRNA-29c在Gleason評分及臨床分期越高的前列腺癌患者中表達越低，Gleason評分代表前列腺癌的腫瘤分化程度，積分為2、3、4分者屬于高分化腺癌；5、6、7分者屬于中分化腺癌；8、9、10分者屬于低或者未分化癌，據此可推測miRNA-29c可能參與了前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程及侵襲轉移過程。

綜上所述，目前對于前列腺癌的早期診斷，缺乏靈敏度和特異度較高的診斷標志物，需要尋找具有較高靈敏度及特異度的診斷標志物來進一步提高前列腺癌患者的診斷率。本研究結果提示miRNA-29c在前列腺癌組織及血清中低表達，且miRNA-29c的表達與前列腺癌臨床分期、病理學分級和遠處轉移等具有相關性，低表達的 miRNA-29c可能參與了前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，對其檢測在前列腺癌患者的早期診斷及預后判斷中具有一定價值。