氣相色譜-質譜聯用法測定瘤胃液中的甲酸和其他6種揮發性脂肪酸

許麗衛 耿梅梅 陳 聞 張麗萍 賀 珍 袁紅朝 彭 燦 李春勇 賀志雄 王久榮

(中國科學院亞熱帶農業生態研究所，亞熱帶農業生態過程重點實驗室，長沙 410125)

飼糧被反芻動物采食，其碳水化合物在瘤胃微生物發酵下生成可利用的終產物揮發性脂肪酸(VFA)，主要成分是乙酸、丙酸和丁酸，可為反芻動物提供75%以上的代謝能，是最主要的能量來源[1]。碳水化合物在瘤胃的代謝過程中，可以由丙酮酸生成甲酸，而且甲酸在厭氧條件下可以生成二氧化碳和氫，進而在產甲烷菌的作用下生成甲烷[2-3]。反芻動物瘤胃甲烷的生成不僅造成動物能量的巨大損失，而且甲烷作為一種重要的溫室氣體，對地球生態環境產生破壞性作用[4-5]。因此，對瘤胃液中揮發性脂肪酸的檢測，尤其是甲酸的檢測對于深入系統研究反芻動物體內碳水化合物的消化代謝及甲烷的生成具有重要的意義。

目前，文獻報道的測定揮發性脂肪酸的方法主要有離子色譜法[6-8]、氣相色譜-質譜聯用法[9]、氣相色譜法[10-11]、毛細管電泳法[12]以及微量壓電稱量法[13]。離子色譜法測定甲酸，具有靈敏度高、重現性好的特點，但是其樣品類型主要有泡菜廢水[6]、河流[7]、生物柴油[8]等，前處理過程復雜，所需的樣品量大，不適宜瘤胃液這類樣品量少的樣品檢測；氣相色譜-質譜法測定水中的有機酸需要用到有毒的有機試劑進行樣品萃取，不僅操作費時繁瑣，操作過程還會對環境產生污染[9]，并且甲酸不能在氣相色譜儀的氫火焰離子化檢測器上直接被檢測到，需將其進行衍生后才能測定[11]；毛細管電泳法雖然測定時間短，檢出限低，但僅限于較為干凈的雨水樣品中甲酸和乙酸的測定[12]；微量壓電稱量法電極可循環，環保性能好，但其電極制備是難點，且僅限于空氣中甲酸和乙酸的測定[13]。目前，對反芻動物瘤胃碳水化合物代謝及甲烷生成的相關研究中，所見文獻均涉及到乙酸、丙酸、丁酸等揮發性脂肪酸的測定，幾乎未見甲酸的檢測，最主要的原因是缺乏相應的檢測瘤胃液中甲酸的方法。

(2)含混，含混又稱之為“晦澀”等，與明晰是相對的。部分文學作品給讀者一種含混的感覺都不是作者刻意為之，一般構成這種含混的原因是語言過于簡短、語序顛倒、多義詞的使用。燕卜遜通過大量的研究和分析表明，讀者對一首詩的解讀可以是多種多樣的，并認為含混是優秀詩歌的特征。因此他針對文學作品中出現的含混現象進行了歸類總結，寫成了《含混的七種類型》，后面也會用到其中的一些方法來解讀李商隱的詩歌。

因此，本試驗選用耐水的極性色譜柱，利用25%偏磷酸(m/v)對瘤胃液進行處理，低溫高速離心后采用氣相色譜-質譜聯用法進行分析，以期建立一種測定瘤胃液中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等揮發性脂肪酸的實驗室分析方法，為研究反芻動物瘤胃碳水化合物消化代謝及甲烷的生成提供技術支撐。

黨的十七屆六中全會審議通過的《中共中央關于深化文化體制改革，推動社會主義文化大發展大繁榮若干問題的決定》指出：“深化文化體制改革、推動社會主義文化大發展大繁榮，進一步興起社會主義文化建設新高潮，對奪取全面建設小康社會新勝利、開創中國特色社會主義事業新局面、實現中華民族偉大復興具有重大而深遠的意義。”［3］黨的十八大報告中旗幟鮮明地提出：扎實推進社會主義文化強國建設，讓人民享有健康豐富的精神文化生活，是全面建成小康社會的重要內容。因此，呂劇故鄉傳承、宣傳、做大呂劇文化，創出一條“呂劇搭臺，經濟唱戲”的產業發展之路，對于推動東營“黃藍”經濟區建設，促進經濟騰飛具有重大的現實意義。

空氣儲罐由上下封頭、筒體和附著在空氣儲罐上的若干個接管組成，具體見圖1。筒體和封頭采用焊接方法進行連接，上封頭頂部設有安全閥接口，筒體上部設一出氣口和壓力表接管、中部設有人孔或者檢查孔、下部設進氣口，下封頭的底部設有排污口，下封頭的外壁上設有支座。其中封頭和筒體用材一般為Q235B，Q245R或Q345R。

1 材料與方法

1.1 試劑配制

偏磷酸購自國藥集團有限公司；乙酸、甲酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸標準品為色譜純，購自阿拉丁試劑公司；超純水為中國科學院亞熱帶農業生態過程重點實驗室自制。

分別精確稱取1.027 0 g乙酸、0.388 4 g丙酸、0.091 7 g異丁酸、0.181 0 g丁酸、0.043 3 g異戊酸和0.090 5 g戊酸于100 mL容量瓶中，用超純水定容，其中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸濃度分別為10 270、3 884、917、1 810、433、905 μg/mL，作為儲備液A，用作標準曲線的制備。精確稱取0.121 0 g甲酸于10 mL容量瓶中，配制成濃度為12 100 μg/mL的溶液作為儲備液B，用作標準曲線的制備；以儲備液B為母液，配制成濃度為242.0 μg/mL的溶液作為儲備液C。試驗樣品為中國科學院亞熱帶農業生態研究所畜禽健康養殖研究中心提供的湘東黑山羊和荷斯坦奶牛的瘤胃液，-80 ℃保存備用。

1.2 儀器與設備

ZHANG Xiao-xi, ZUO Qiao, LIU Jian-min, HUANG Qing-hai, XU Yi, ZHAO Rui, YANG Peng-fei, HONG Bo

1.3 色譜條件

Agilent DB-FFAP色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，程序升溫條件：60 ℃，保持2 min，然后以20 ℃/min升至220 ℃，保持0.5 min；進樣口：250 ℃；離子源：230 ℃；四級桿：150 ℃；質譜接口：220 ℃。流速：0.8 mL/min；進樣量：1 μL；分流比：50∶1，選擇離子掃描模式，定量離子選擇質荷比(m/z)：甲酸46，輔助定量離子45、29；乙酸43，輔助定量離子60、45；丙酸74，輔助定量離子73、75；異丁酸43，輔助定量離子41、73；丁酸60，輔助定量離子73、42；異戊酸60，輔助定量離子43、87；戊酸60，輔助定量離子73、41。

1.4 樣品制備

以S4作為供試品，按照1.3色譜條件測定，重復測定7次，考察所建立方法的精密性；以山羊和奶牛瘤胃液樣品為供試品，分別平行取樣3份按1.4進行樣品處理后，經1.3色譜條件測定，考察所建立方法的重復性；以山羊和奶牛瘤胃液樣品為供試品，分別取瘤胃液樣品0.5 mL，各加入100 μL 25%偏磷酸，然后分別向其中加入乙酸、甲酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸的儲備液，即分別向其中加入儲備液A 20 μL，儲備液C 50 μL；儲備液A 40 μL，儲備液C 100 μL；儲備液A 60 μL，儲備液C 200 μL，按1.4處理方法將其制成待測溶液，按1.3色譜條件上機測定加標回收率以及驗證方法的普適性。

1.5 試驗條件優化

大港油田主體位于濱海新區和渤海新區，真正具備油田征地條件的陸地面積不足4000平方千米。如何實現與地方共同、協調和綠色發展？大港油田探索出了一條地質工程一體化開展平臺式井叢場節約用地鉆井建產的道路。

7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀(Agilent，美國)，配備有電子轟擊(EI)離子源和四級桿質量分析儀，自動進樣器；CR22 GⅡ冷凍離心機(日立，日本)；Classic DI超純水系統(ELGA，英國)；0.22 μm濾膜(希波氏，中國)。

1.5.1 樣品與25%偏磷酸體積比的選擇

以瘤胃液樣品為試驗樣品，充分混勻，18 000 r/min離心10 min，取上層清液。將上層清液與25%偏磷酸分別按照體積比為6∶1、7∶1、8∶1、9∶1和10∶1的比例混合均勻，靜置30 min后，4 ℃條件下18 000 r/min離心10 min，取上層清液過0.22 μm濾膜后，進行氣相色譜-質譜分析。以上層清液與25%偏磷酸的體積比為橫坐標，各對應目標物質的色譜峰峰面積為縱坐標作圖。

以瘤胃液樣品為試驗樣品，分別對樣品與25%偏磷酸的體積比以及25%偏磷酸的處理時間進行優化。

1.5.2 25%偏磷酸處理時間的選擇

由圖2可知，25%偏磷酸處理時間在0.5～12.0 h內，不同處理時間對目標物峰面積幾乎無影響，因此處理時間在0.5 h以上即可。

1.6 標準曲線、線性范圍及檢出限

將儲備液A和儲備液B混合稀釋，并按照樣品與25%偏磷酸體積比為9∶1混合均勻，配制成各目標物濃度(表1)的S1、S2、S3、S4、S5、S6系列標準曲線。以各目標物的濃度為橫坐標(X)，目標物峰面積為縱坐標(Y)作圖，得線性回歸方程；以目標物3倍信噪比的濃度為其檢出限，10倍信噪比的濃度為其定量限。

表1 標準樣品濃度

1.7 方法的精密性、重復性和回收率考察

將瘤胃液樣品4 ℃解凍，充分混勻，18 000 r/min離心10 min，取上層清液。將上層清液與25%的偏磷酸按照9∶1(v∶v)比例混合均勻，靜置0.5 h后，4 ℃條件下18 000 r/min離心10 min，取上層清液過0.22 μm濾膜，進行氣相色譜-質譜分析。

2 結果與分析

2.1 樣品與25%偏磷酸體積比的選擇

由表1可知，甲酸、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸分別在0.8～121.0 μg/mL、0.3～3 081.0 μg/mL、0.4～1 165.2 μg/mL、0.4～275.1 μg/mL、0.2～543.0 μg/mL、0.5～129.9 μg/mL和 0.4～271.5 μg/mL內線性關系良好，線性相關系數均達到0.998以上，檢出限(3倍信噪比)分別為0.252、0.098、0.105、0.124、0.069、0.148和0.116 μg/mL，結果見表2。標準品和樣品中甲酸和其他6種揮發性脂肪酸的總離子流圖見圖3。圖3樣品中甲酸、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸的濃度分別為28.4、1 715.5、894.2、35.1、154.8、22.6和34.3 μg/mL。

圖1 樣品與25%偏磷酸體積比的選擇對目標物的影響

2.2 25%偏磷酸處理時間的選擇

以瘤胃液樣品為試驗樣品，充分混勻，18 000 r/min離心10 min，取上層清液。將上層清液與25%偏磷酸按照體積比9∶1的比例混合均勻后，分別靜置0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0和12.0 h后，4 ℃條件下18 000 r/min離心10 min，取上層清液過0.22 μm濾膜后，進行氣相色譜-質譜分析。以25%偏磷酸處理時間為橫坐標，各對應目標物質的色譜峰峰面積為縱坐標作圖。

圖2 25%偏磷酸處理時間對目標物的影響

2.3 標準曲線、線性范圍及檢出限

由圖1可知，當樣品與25%偏磷酸的體積比在6∶1～10∶1時，各個目標物的峰面積基本保持不變，為了操作方便，選擇樣品與25%偏磷酸的體積比為9∶1。

1：乙酸；2：甲酸；3：丙酸；4：異丁酸；5：丁酸；6：異戊酸；7：戊酸。

表2 甲酸和其他6種揮發性脂肪酸的線性方程、線性范圍、線性相關系數以及檢出限

2.4 方法的精密性、重復性和回收率考察

方法精密性檢測結果表明，各色譜峰保留時間的相對標準偏差不超過0.5%，峰面積的相對標準偏差不超過5.0%，說明本方法精密性良好；方法的重復性檢測結果表明，各色譜峰保留時間的相對標準偏差不超過0.5%，各色譜峰的峰面積的相對標準偏差不超過5.0%；回收率檢測結果表明，山羊瘤胃液樣品的加標回收率為91.8%～103.8%，結果見表3；奶牛瘤胃液樣品的加標回收率為78.7%～95.2%，結果見表4。加標回收率結果表明該方法對反芻動物瘤胃液樣品中揮發性脂肪酸的測定具有普適性。

表3 山羊瘤胃液樣品中甲酸和其他6種揮發性脂肪酸的加標回收率

表4 奶牛瘤胃液樣品中甲酸和其他6種揮發性脂肪酸的加標回收率

3 討 論

瘤胃液中含有大量的脂質、蛋白質以及微生物等雜質，如果不能去除脂質和蛋白質，加上微生物的活動，將導致瘤胃液樣品即使當天過濾澄清以后，不僅很快又會變得渾濁，阻塞測樣系統如進樣針等，而且還會造成揮發性脂肪酸的損失。加入25%偏磷酸，既可以去除大部分蛋白質和脂質物質，同時還可以固定揮發性脂肪酸，抑制揮發性脂肪酸的揮發。

證明 (1)由τCSI?τ,clX{x}?clCSI(X){x},下證clCSI(X){x}?clX{x},只需證XclX{x}?XclCSI(X){x}。注意到XclCSI(X){x}=intCSI(X)(X{x})及XclX{x}?X{x},于是又只需證XclX{x}∈τCSI即可。

正常情況下，甲酸在瘤胃液內為中間產物，濃度較低，一般在0～46 μg/mL，很快被瘤胃壁吸收或微生物利用。與甲酸相比，瘤胃液中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸等揮發性脂肪酸的濃度要高很多，易于檢測。因此，在提升甲酸檢測靈敏度的同時，還要兼顧其他揮發性脂肪酸檢測的準確性，以及它們的濃度對色譜柱造成的損傷。甲酸的揮發性較強，即使其濃度較低，仍不能通過常規的濃縮方法來增加樣品量進行富集，因為處理過程中會造成目標物的極大損失，難于檢測其準確濃度甚至不能檢測出。本方法中甲酸的線性范圍最高為121.0 μg/mL，完全可以滿足反芻動物瘤胃液樣品的檢測。

本試驗建立的方法利用氣相色譜-質譜聯用法的選擇離子模式，減少了其他非目標離子的干擾，提高了檢測的靈敏度，而且所需樣品量較少，1 mL的樣品即能滿足測定需求，且在反芻動物瘤胃液樣品中具有普適性。因此，本方法的實驗室可操作性強，實驗室人員易于上手，利于檢測方法的推廣應用。

4 結 論

本試驗建立了一種采用外標法測定瘤胃液中甲酸、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸的氣相色譜-質譜聯用方法。這7種組分色譜峰保留時間的相對標準偏差均小于0.5%，峰面積的相對標準偏差均小于5.0%，線性相關系數均在0.998以上，檢出限(3倍信噪比)在0.069～0.252 μg/mL；山羊和奶牛瘤胃液樣品的加標回收率分別為91.8%～103.8%和78.7%～95.2%。該方法前處理簡單，樣品用量少，靈敏度高，易于實驗室中檢測瘤胃液中甲酸及其他揮發性脂肪酸，可為系統研究反芻動物瘤胃碳水化合物代謝及甲烷生成提供技術支撐。