藏綿羊暖、冷季瘤胃微生物菌群密度與其短鏈脂肪酸濃度互作分析

史 浩 沙玉柱 魏 紅 呂衛兵 文禹梁 劉 秀 羅玉柱 王繼卿 李少斌 胡 江

(甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅省草食動物生物技術重點實驗室，蘭州 730070)

藏綿羊又稱藏系綿羊，是中國三大原始綿羊品種(蒙古羊、藏綿羊、哈薩克羊)之一，繁育在海拔3 000 m以上的青藏高原地區，存欄量約2 500萬只，是中國群體數量最大的綿羊品種。藏綿羊生活在高寒低氧的環境中，全年放牧飼養，主要通過采食天然牧草獲取營養。

藏綿羊對青藏高原的高寒低氧和冷季營養匱乏等嚴酷生態因子具有較好的適應性，但暖、冷季營養供給嚴重不均衡是限制藏綿羊產業發展的主要因素。所以，解析藏綿羊應對冷季營養脅迫的適應策略、提高藏綿羊適應冷季營養匱乏的能力成為其保護利用的主要目標。

動物的生長、發育和健康(所有功能)都受到所處環境微生物的影響，并決定了宿主的生理、行為、生態和進化[1-2]。多樣化和反應靈敏的腸道菌群是動物適應的重要機制，使動物個體能夠適應飼糧營養成分和質量隨季節變化而變化的廣泛采食[3]。瘤胃是反芻動物發酵、消化和代謝的重要場所，對反芻動物營養物質消化和吸收起著至關重要的作用[4]。反芻動物瘤胃中含有大量微生物，包括細菌、原蟲和真菌等，其中細菌種類最多，約7 000種，在瘤胃中通過發酵對纖維物質進行消化吸收[5]。根據底物和發酵產物不同，將細菌分為纖維降解菌[包括黃色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)、產琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)]、部分溶纖維丁酸弧菌、半纖維素降解菌、蛋白質降解菌[包括溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)和嗜淀粉瘤胃桿菌(Ruminobacteramylophilus)]、脂肪降解菌等[6-8]；瘤胃中的原蟲主要為纖毛蟲和極少數的鞭毛蟲，雖在瘤胃中少于細菌，但體積較大，占瘤胃微生物的30%～80%，由于牧草營養成分的影響，反芻動物瘤胃中的細菌及原蟲數量與種類也會隨之發生改變[9-10]。

短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFA)與反芻動物瘤胃營養以及瘤胃微生物之間有著密切的關系，瘤胃通過對養分的消化吸收產生大量SCFA，且不同種類SCFA對反芻動物生理作用不同，SCFA是有機物質在瘤胃中發酵的主要產物，同時，可以使瘤胃保持一個理想的酸性環境，從而形成一個良性循環的瘤胃環境[11-12]。相對于瘤胃微生物來說，瘤胃中的SCFA由瘤胃微生物厭氧發酵產生，包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸等，對動物體代謝作用最為重要的有乙酸、丙酸和丁酸，約占瘤胃SCFA的95%[13]。研究顯示，瘤胃微生物的組成和多樣性也與瘤胃SCFA組成相關[14]。目前，針對藏綿羊不同季節瘤胃微生物菌群密度與SCFA濃度互作的研究鮮見報道，已有研究主要針對藏綿羊瘤胃纖毛蟲種群動態受季節影響、瘤胃細菌數量及其放牧地牧草養分隨季節變化以及放牧綿羊瘤胃液中SCFA濃度隨季節而發生動態變化[9,15-16]。因此，本試驗旨在探討暖、冷季藏綿羊瘤胃SCFA濃度、微生物菌群密度及其互作特征，進而為藏綿羊應對不同季節營養供給變化的適應機制研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

在甘肅省甘南藏族自治州合作市佐蓋曼瑪鄉(海拔3 300 m)同一牧戶羊群選取1周歲(±1月齡)、身體健康、體重[(35.12±1.43)kg]相近、自然放牧的歐拉型藏綿羊母羊12只。分別在7(暖季)和12月(冷季)采集藏綿羊瘤胃液。試驗羊只歸牧后，在次日早晨測量體重，利用羊用胃管式瘤胃采樣器采集瘤胃液，將樣品立刻放入準備好的液氮罐中進行冷凍保存，帶回實驗室-80 ℃保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 藏綿羊瘤胃SCFA濃度測定

利用島津(GC-2010 plus)氣相色譜儀測定瘤胃SCFA濃度，內標為2-乙基丁酸(2EB)，色譜柱：AT-FFAP(50 m×0.32 mm×0.25 μm)毛細管柱。色譜柱程序升溫：溫度60 ℃保持1 min，以5 ℃/min升至115 ℃，不保留，再以15 ℃/min升至180 ℃，檢測器溫度260 ℃，進樣口溫度250 ℃。

1.2.2 瘤胃微生物菌群密度測定

利用天根糞便基因組DNA提取試劑盒(DP-328)提取藏綿羊瘤胃微生物總DNA。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性和純度，用超微量分光光度計(Therm Nano Drop-2000)檢測OD260/280的值。

以瘤胃微生物DNA為模板，選取產甲烷菌(Methanogenic bacteria)、蛋白質降解菌(包括溶纖維丁酸弧菌和嗜淀粉瘤胃桿菌)、纖維降解菌(產琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌)進行相對定量研究。利用NCBI BLAST(www.ncbi.nih.gov/BLAST)搜尋菌群16S rRNA序列，采用Primers軟件設計特異性引物(表1)，引物由上海生物工程有限公司合成。以細菌為內參，引物序列參考Muyze等[17]研究方法，利用熒光定量PCR儀(ABI QuantStudio-6)測定微生物黃色瘤胃球菌、產琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌、嗜淀粉瘤胃桿菌、溶纖維丁酸弧菌和產甲烷菌的相對密度。PCR反應體系20 μL：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，上、下游引物各0.6 μL，模板1 μL，50×Rox Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 7.4 μL。反應參數：95 ℃預變性15 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火32 s，共40個循環。

表1 菌群引物序列

1.3 數據統計分析

試驗數據利用Excel 2010進行整理，然后采用SPSS 21.0軟件進行統計分析，數據用平均值±標準差來表示。SCFA濃度及比例進行獨立樣本t檢驗和單因素方差分析，目的菌相對密度采用2-△△Ct法分析。瘤胃SCFA濃度與微生物區系相對密度進行Spearman相關性分析。

2 結果與分析

2.1 藏綿羊暖、冷季瘤胃SCFA濃度及比例的測定結果

由表2可知，冷季總SCFA濃度顯著高于暖季(P<0.05)，其中，乙酸與丙酸濃度在冷季顯著高于暖季(P<0.05)，而其他SCFA濃度在暖、冷季無顯著差異(P>0.05)；各種SCFA所占比例分析發現，異丁酸比例在暖、冷季無顯著差異(P>0.05)，冷季乙酸、丙酸比例顯著高于暖季(P<0.05)，而暖季丁酸、異丁酸、異戊酸、戊酸比例顯著高于冷季(P<0.05)。冷季乙酸/丙酸顯著高于暖季(P<0.05)。

表2 藏綿羊瘤胃SCFA濃度及比例的測定結果

2.2 藏綿羊暖、冷季瘤胃微生物菌群密度的測定結果

由圖1可知，藏綿羊暖、冷季瘤胃微生物菌群密度存在顯著差異(P<0.05)，暖季瘤胃黃色瘤胃球菌、產琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌、嗜淀粉瘤胃桿菌和產甲烷菌的相對密度顯著高于冷季(P<0.05)；暖季瘤胃微生物菌群中黃色瘤胃球菌、產琥珀酸絲狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌之間的相對密度均差異顯著(P<0.05)，而白色瘤胃球菌、嗜淀粉瘤胃桿菌和產甲烷菌之間相對密度差異不顯著(P>0.05)；冷季瘤胃微生物菌群中黃色瘤胃球菌和產琥珀酸絲狀桿菌的相對密度差異顯著(P<0.05)，而白色瘤胃球菌、嗜淀粉瘤胃桿菌、溶纖維丁酸弧菌和產甲烷菌之間相對密度差異不顯著(P>0.05)。

Rf：黃色瘤胃球菌 Ruminococcus flavefaciens；Fs：產琥珀酸絲狀桿菌 Fibrobacter succinogenes；Ra：白色瘤胃球菌 Ruminococcus albus；Ram：嗜淀粉瘤胃桿菌 Ruminobacter amylophilus；Bf：溶纖維丁酸弧菌 Butyrivibrio fibrisolvens；MB：產甲烷菌 Methanogenic bacteria。

2.3 藏綿羊暖、冷季瘤胃SCFA濃度與其菌群密度的相關性分析

由表4可知，6種SCFA濃度之間存在相關性，其中，乙酸、丙酸與異戊酸、戊酸濃度呈顯著負相關(P<0.05)，而乙酸與異丁酸濃度呈極顯著負相關(P<0.01)，相關性系數均大于0.900；反之，異丁酸與異戊酸、戊酸濃度呈極顯著正相關(P<0.01)，相關系數均在0.950以上；其中丁酸與其他5種SCFA濃度之間無顯著相關性(P>0.05)。

表4 藏綿羊暖、冷季瘤胃SCFA濃度間相關性分析

由表5可知，SCFA濃度與微生物菌群相對密度之間存在相關性，其中，乙酸濃度與黃色瘤胃球菌相對密度呈極顯著正相關(P<0.01)，相關系數大于0.950，與產琥珀酸絲狀桿菌、嗜淀粉瘤胃桿菌、溶纖維丁酸弧菌、產甲烷菌相對密度呈極顯著負相關(P<0.01)；丙酸濃度與白色瘤胃球菌相對密度呈極顯著正相關(P<0.01)，相關系數大于0.900，與產琥珀酸絲狀桿菌相對密度呈極顯著負相關(P<0.01)；異戊酸、戊酸濃度與黃色瘤胃球菌相對密度呈極顯著負相關(P<0.01)，相關系數均在0.950以上；異戊酸、戊酸濃度與白色瘤胃球菌相對密度呈顯著負相關(P<0.05)，相關系數均在0.850以上；反之，異丁酸、異戊酸、戊酸濃度與黃色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌、產甲烷菌相對密度呈顯著正相關(P<0.05)。另外，丙酸濃度與黃色瘤胃球菌、嗜淀粉瘤胃桿菌、溶纖維丁酸弧菌、產甲烷菌相對密度之間無顯著相關性(P>0.05)，而丁酸濃度與6種微生物菌種相對密度均無顯著相關性(P>0.05)。

表5 藏綿羊暖、冷季瘤胃SCFA濃度與微生物菌群相對密度的相關分析

3 討 論

3.1 藏綿羊暖、冷季瘤胃SCFA濃度變化特征

SCFA濃度是衡量瘤胃發酵方式與能力的關鍵參數，也是藏綿羊瘤胃微生物合成的重要能量來源[18]。瘤胃SCFA濃度和組成差異主要是由于飼糧的差異(即中性洗滌纖維)，導致瘤胃微生物活性和比例的不同，最終影響瘤胃SCFA濃度和組成[19]。在本試驗中，藏綿羊冷季瘤胃中乙酸、丙酸濃度顯著高于暖季，可能與暖季牧草營養豐富、個體采食量大、瘤胃易發酵、體內碳水化合物充足有關，為瘤胃微生物生長提供充足養分，從而為產乙酸菌生長增殖提供充足的氮源。瘤胃內纖維分解菌生長速度快，分解纖維能力顯著增加，為甲烷菌生長增殖提供充足的氫源，產乙酸菌與甲烷菌通過氫氣和二氧化碳反應生產甲烷與乙酸，且甲烷含量高于乙酸。因此，暖季甲烷含量升高導致乙酸含量降低[20]。從各種SCFA所占比例進行分析，發現異丁酸比例在暖、冷季間無顯著差異，冷季乙酸比例顯著高于暖季，而丁酸和其他SCFA比例則是暖季顯著高于冷季。另外，乙酸/丙酸在冷季顯著高于暖季，這與魏德泳等[21]研究結果一致。在枯草期，牧草中結構性碳水化合物含量較高，中性洗滌纖維含量高于青草期和返青期，纖維含量較高，乙酸發酵為主，使得瘤胃乙酸/丙酸升高。SCFA濃度是瘤胃發酵的主要指標之一[22]，SCFA為反芻動物提供70%～80%的能量，其中，乙酸、丙酸和丁酸是SCFA的主要組成，占SCFA的95%，與能量的利用率有著很大的關聯[23]，而本研究中，藏綿羊冷季瘤胃中乙酸、丙酸濃度顯著高于暖季，可能與藏綿羊特殊的冷季適應性有關，為應對嚴酷的冷季環境，表現出高效的能量利用效率。王月[24]研究表明，季節變化對內蒙古白絨山羊瘤胃發酵特性及其微生物區系有一定的影響，阿爾巴斯型和二狼山型絨山羊冷季瘤胃中乙酸濃度顯著高于暖季；暖季阿拉善型羊瘤胃SCFA濃度顯著高于其他2個類型，而冷季則顯著低于其他2個類型，前者與本試驗結果一致；后者與本試驗結果相反，可能由于地域的差異及環境不同造成。

3.2 藏綿羊暖、冷季瘤胃微生物菌群密度變化特征

反芻動物出生時，瘤胃內并無微生物，隨著出生1 d后，通過母畜的哺乳及周邊環境的影響，在體內形成了瘤胃微生物區系并逐漸完善，進而達到一個相對穩定及平衡的狀態，瘤胃微生物包括細菌、原蟲和真菌三大類，瘤胃微生物的組成及結構不僅對維持瘤胃吸收與健康具有重要作用，還是調控瘤胃微生物區系的重要組成[25-26]。李長青等[27]對放牧綿羊不同季節瘤胃細菌多樣性動態變化特征研究發現，牧草的營養狀況能顯著影響瘤胃的細菌分布，導致不同季節瘤胃消化不同；研究表明，依靠瘤胃降解的纖維細菌主要有3種，分別為黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和產琥珀酸絲狀桿菌[28]。同時，瘤胃中還有大量產甲烷菌，可將其他微生物發酵產生甲烷，通過打嗝排出體外，雖不利于環境保護，但在瘤胃中能維持正常的氫氣分壓及瘤胃的發酵并起著重要的作用[29]。本試驗中，藏綿羊暖、冷季瘤胃微生物菌群中黃色瘤胃球菌、產琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌、嗜淀粉瘤胃桿菌、產甲烷菌、溶纖維丁酸弧菌的相對密度為暖季顯著高于冷季。可能與暖季個體采食量大、牧草營養豐富易發酵產生充足的碳水化合物有關，為瘤胃微生物生長提供充足養分，瘤胃中纖維素含量增加的同時纖維分解菌的數量也相應增加，能夠向瘤胃微生物提供更多易消化的細胞壁物質、蛋白質和營養底物，有利于刺激纖維分解菌的生長和繁殖，與劉大程等[30]的研究結果一致。阿拉善型絨山羊產琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌相對密度暖季顯著高于冷季，白色瘤胃球菌相對密度暖、冷季間差異不顯著[31]，與本試驗結果一致。本試驗中，冷季瘤胃微生物菌群中黃色瘤胃球菌和產琥珀酸絲狀桿菌的相對密度差異顯著，而白色瘤胃球菌、嗜淀粉瘤胃桿菌、溶纖維丁酸弧菌和產甲烷菌相對密度差異不顯著，與靳繼鵬等[32]的研究結果一致；另外，本試驗中，暖、冷季瘤胃微生物菌群中產甲烷菌相對密度差異不顯著，與淡瑞芳等[33]的研究結果一致。同時，高海拔的藏綿羊相比低海拔藏綿羊產甲烷菌含量低[34]。所以，飼草質量、SCFA濃度、海拔等都會影響瘤胃微生物菌群多樣性及密度，因而，對動物瘤胃的菌群密度進行研究，將有助于揭示動物的適應性機制，從而為動物的飼養管理提供參考。

3.3 藏綿羊瘤胃SCFA濃度與微生物菌群密度的相關性

瘤胃SCFA濃度與反芻動物瘤胃營養以及瘤胃微生物之間存在著密切的關系，通過對養分的消化吸收產生大量的SCFA，且不同種類SCFA對反芻動物生理作用不同，瘤胃微生物是有機物質在瘤胃中發酵的主要產物，其中的一部分被其他微生物所利用。瘤胃中產琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌通過分解纖維素主要產生乙酸和琥珀酸鹽，而白色瘤胃球菌的主要發酵產物是乙酸，嗜淀粉瘤胃桿菌、產琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌及其他細菌等也產生琥珀酸鹽，琥珀酸鹽是丙酸產生的中間產物，黃色瘤胃球菌的最終代謝產物主要是氫、乙酸和甲酸，以及少量的乙醇和乳酸[35]。本試驗發現，藏綿羊瘤胃乙酸和丙酸濃度與產琥珀酸絲狀桿菌相對密度呈顯著負相關，乙酸濃度與黃色瘤胃球菌相對密度呈顯著正相關，說明黃色瘤胃球菌是藏綿羊乙酸產生的重要分解菌群，也是藏綿羊瘤胃能量供給的重要SCFA。鐘書[36]通過對溫濕度指數(THI)介導山羊瘤胃細菌群落的變化研究發現，產琥珀酸絲狀桿菌相對密度與丙酸濃度呈負相關，與乙酸濃度呈正相關，前者與本試驗結果一致，后者與本試驗結果相反，可能隨著暖、冷季的變化，瘤胃發酵類型趨于乙酸型，緩解纖維素分解菌的抑制，使瘤胃內氫的濃度升高，從而促進甲烷菌生長，增加了甲烷的產量；另外，Yang等[37]研究結果表明，乙酸濃度與產琥珀酸絲狀桿菌相對密度呈顯著正相關，與本試驗結果一致。

4 結 論

暖、冷季瘤胃微生物菌群密度與SCFA濃度存在顯著性差異；進一步相關性分析發現，SCFA濃度與菌群密度之間存在一定的相關性，這種互作機制可能在藏綿羊應對暖、冷季的適應性方面發揮著重要作用，研究結果將為藏綿羊產業發展及種質資源保護利用提供參考。