母牛舔舐對新生犢牛行為及血清應激和免疫指標的影響

靳 爽 李聰聰 顧憲紅

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，動物營養學國家重點實驗室，北京 100193)

對于大多數的哺乳動物來說，分娩后母畜舔舐新生幼畜是一種常見的行為，通過舔舐可以去除幼畜身上的羊水和黏液，使其被毛盡快干燥，有利于提高幼畜對外界環境的適應性及成活率。舔舐過程中的氣味識別和觸覺接觸會使母畜與幼畜之間形成母子聯系，使得母畜可以辨別自己的幼仔，達到更好的護理和哺育效果。對于奶牛來說，在沒有人為干預的情況下，在分娩后1 h內母牛會花費30%～50%的時間舔舐犢牛[1]。在犢牛生命早期，母牛的存在對犢牛的生長起到積極作用。研究發現，在人工使用奶瓶飼喂犢牛相同數量初乳的情況下，初乳飼喂期與母牛共同飼養的犢牛較母子分開飼養的犢牛日增重多，且生長后期的社會行為表現更為活躍[2]。當犢牛與母牛相處時間增長時，會減少犢牛對陌生環境的恐懼以及利于未來的母性行為表達，犢牛健康、體重增加和未來的生產性能也會提高，同時長期來看，犢牛的存在對母牛的健康和生產性能也有積極影響[3]。在自然條件下，母牛會和犢牛在一起生活6～8個月，在這期間，母牛對犢牛進行哺乳，犢牛可以自然地度過斷奶期[4]。而在現代化的奶牛養殖中，生產者為了保證對犢牛進行規范化的人工管理，避免在母子關系建立之后進行母子分離的困難和負面影響，并保證奶牛分娩后能夠盡快適應正常的生產流程，一般會在產后對奶牛和犢牛立即進行分離。然而，有觀點認為，早期分離對犢牛和母牛來說是一種情感上的應激，會對它們的健康產生負面影響[5]。產后立即分離母牛和犢牛的操作剝奪了犢牛被舔舐的機會，從而使得犢牛在面臨母體內環境與外界環境巨大差異的應激條件下不能得到母牛的護理和安撫，這種管理方式降低了母牛和犢牛福利水平[6]。在瑞典、丹麥和挪威的有機乳制品生產中，為了使母牛和犢牛能夠進行母子接觸，規定了養殖場必須允許犢牛在出生后由母牛進行至少1～3 d的哺乳，以提高犢牛的健康和福利水平[7-8]。我國奶牛場養殖規模較大，這種飼養方式不符合生產實際，但是在產后不立即將犢牛轉移走，允許母牛有時間對犢牛進行舔舐，這種操作是可以實現的，但效果如何未見報道。因此，本研究通過行為觀察和血清指標測定，探究母牛舔舐對新生犢牛的影響，以期為新生犢牛的管理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

本試驗于2019年2—4月在山東省曹縣銀香偉業集團百澳國際牧場進行。

1.2 試驗設計及飼養管理

試驗選取了30頭健康的荷斯坦母犢牛，依據犢牛出生后被母牛舔舐的時長分為2組，對照組(Con組)犢牛出生后僅被舔舐了幾下或者沒被舔舐，舔舐組(Lick組)犢牛出生后被舔舐15～20 min，每組15頭。2組犢牛初生重[Con組(37.75±0.58)kg，Lick組(38.00±0.78)kg]相近。Con組母牛的胎次均為1胎，Lick組母牛的胎次為1～2胎(平均1.4胎)，2組母牛體況適宜(體況評分為3.5～3.75)。犢牛在出生后24 h內由人工使用奶瓶分3次共喂食6 L初乳。犢牛第1次采食的初乳為母乳，第2、3次提供混合初乳，每次飼喂量均為2 L。Lick組犢牛出生后在產圈中被母牛舔舐15～20 min后，而后轉移至產圈外等待母牛擠初乳；Con組犢牛出生后5 min內僅被母牛舔舐幾下或未被舔舐，而后轉移至產圈外等待母牛擠初乳。使用奶瓶將新鮮擠出的初乳飼喂給犢牛2 L，然后為犢牛打耳號，使用5%碘酊對犢牛臍帶進行消毒處理，然后將其轉移至犢牛舍中進行小群飼養。將4～5頭犢牛飼養在3 m×4 m的鋪有稻殼墊料的犢牛舍中，犢牛舍內設有暖燈和通風系統，根據天氣情況調整暖燈開通數量和通風與否，以保證犢牛舍溫度范圍在15 ℃左右。

1.3 樣品采集與指標檢測

1.3.1 行為指標的記錄與觀察

犢牛舍中安裝有攝像機(杭州海康威視數字技術股份有限公司)，將犢牛轉移至犢牛舍后，系統立刻開啟視頻監控，直至24 h后結束攝像記錄。Lick組犢牛進入犢牛舍的時間為出生后(32.60±2.36)min，Con組犢牛進入犢牛舍的時間為出生后(28.53±2.97)min。觀察的行為指標包括3個方面：1)犢牛第1次站立行為。記錄犢牛初次嘗試站立的時間(進入犢牛舍至犢牛初次嘗試站立的時間間隔)、初次成功站立的時間(進入犢牛舍至犢牛初次成功站立的時間間隔)、初次嘗試站立到初次成功站立的時間間隔以及嘗試站立的次數。2)犢牛第2、3次采食初乳時的行為。記錄犢牛采食初乳時長、采食初乳時站立時長、采食初乳時躺臥時長。3)犢牛在第2、3次采食初乳前、后15 min的行為。記錄犢牛站立、躺臥、行走、跑跳、探索、自我梳理行為的時長和次數，記錄頭部頂撞和搖頭行為的次數。犢牛的行為和行為定義見表1。

表1 犢牛的行為和行為定義

1.3.2 血清樣品的采集與測定

在犢牛被舔舐之后采食初乳之前(0 h)和被舔舐后24 h時進行頸靜脈采血10 mL，將血液室溫靜置30 min，3 000×g、4 ℃離心15 min后制備完成血清樣品，于-20 ℃冰箱中保存待測。血清皮質醇(cortisol，COR)、白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、白細胞介素-4(interleukin-4，IL-4)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)含量采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定，其中COR試劑盒由上海江萊生物有限公司提供，IL-2、IL-4、IL-6、IL-1β、TNF-α試劑盒由武漢華美生物工程有限公司提供，嚴格按照說明書步驟進行操作。

1.4 數據統計與分析

采用SAS 9.4軟件對所有數據進行統計分析，犢牛第1次站立行為中的時長以分鐘(min)為單位進行描述，采用t檢驗進行分析；第2、3次采食初乳所用時長以秒(s)為單位進行描述，統計每頭犢牛在第2、3次采食初乳時站立時長占總采食時長的比例以及躺臥時長占總采食時長的比例，對數據進行反正弦平方根轉換，然后使用MIXED模塊對數據進行重復測量的方差分析，以第2、3次采食初乳作為重復測量；采食初乳前、后15 min各行為時長以秒(s)為單位進行描述，為使數據滿足正態分布，對各行為時長進行log(x+1)數據轉換，對各行為發生次數進行平方根數據轉換，然后使用MIXED模塊對各行為時長和發生次數進行重復測量的方差分析，以第2、3次采食初乳作為重復測量。犢牛血清指標數據采用t檢驗進行分析，結果以“平均值±標準誤”表示。P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示有差異顯著趨勢。

2 結 果

2.1 新生犢牛第1次站立行為

由圖1-a可知，Lick組犢牛進入犢牛舍后初次嘗試站立用時與Con組無顯著差異(P>0.10)。由圖1-b可知，Lick組犢牛進入犢牛舍后初次成功站立用時有低于Con組的趨勢(P=0.056)。由圖1-c、圖1-d可知，Lick組犢牛進入犢牛舍后在初次嘗試站立至成功站立期間的嘗試站立次數有低于Con組犢牛的趨勢(P=0.094)，且初次嘗試站立至成功站立用時顯著短于Con組(P<0.05)。

圖1 新生犢牛第1次站立行為

2.2 新生犢牛第2、3次采食初乳時的行為

由圖2-a可知，對犢牛第2、3次采食初乳過程中采食初乳時長進行分析的結果顯示，處理的主效應不顯著(P>0.10)，Lick組犢牛采食初乳時長與Con組無顯著差異(P>0.10)，采食次數的主效應不顯著(P>0.10)，處理效應和采食次數效應的交互作用不顯著(P>0.10)。犢牛在采食初乳時要么呈站立狀態，要么呈躺臥狀態。分別記錄了犢牛第2、3次采食初乳時站立和躺臥時長占總采食時長的比例，并加以比較。由圖2-b、圖2-c可知，Lick組犢牛采食初乳過程中站立時長占總采食時長的比例有高于Con組的趨勢(P=0.068)，Lick組犢牛躺臥時長占總采食時長的比例有低于Con組的趨勢(P=0.068)，采食次數的主效應不顯著(P>0.10)，處理效應和采食次數效應的交互作用不顯著(P>0.10)。

圖2 新生犢牛第2、3次采食初乳時的行為

2.3 新生犢牛第2、3次采食初乳前、后15 min的行為

由表2和表3可知，Lick組犢牛在第2、3次采食初乳前、后15 min內的站立時長和次數顯著高于Con組(P<0.05)，躺臥時長顯著低于Con組(P<0.05)，行走時長和次數顯著高于Con組(P<0.05)。Lick組犢牛在第2、3次采食初乳前、后15 min內的探索時長有高于Con組的趨勢(0.05≤P<0.10)，探索次數顯著高于Con組(P<0.05)。2組犢牛在第2、3次采食初乳前、后15 min內的跑跳時長和次數、自我梳理時長和次數沒有顯著差異(P>0.10)。

表2 母牛舔舐對新生犢牛第2、3次采食初乳前、后15 min行為時長的影響

表3 母牛舔舐對新生犢牛第2、3次采食初乳前、后15 min行為次數的影響

采食初乳后與采食初乳前相比，犢牛的站立時長和次數、行走時長和次數、跑跳時長和次數、探索時長和次數、頭部頂撞次數和搖頭次數顯著增多(P<0.05)，躺臥時長和次數顯著降低(P<0.05)，自我梳理時長和次數沒有顯著差異(P>0.10)。

2.4 母牛舔舐對新生犢牛血清應激和免疫指標的影響

由表4可知，在被舔舐后24 h，Lick組犢牛血清IL-2含量有低于Con組的趨勢(P=0.097)，血清IL-6含量顯著低于Con組(P<0.05)。在被舔舐后0 h，Lick組犢牛血清COR含量顯著低于Con組(P<0.05)。2組犢牛血清IL-4、IL-1β和TNF-α含量在被舔舐后0、24 h時均無顯著差異(P>0.10)。

表4 母牛舔舐對新生犢牛血清應激和免疫指標的影響

3 討 論

3.1 母牛舔舐對新生犢牛初次站立時間的影響

出生后表現出較高的活力對新生幼畜的存活和生長至關重要，并且能使新生幼畜獲得較好的福利水平[12-13]。通常將犢牛在沒有任何外界幫助情況下站立的能力定義為犢牛的活力[14]。幼畜出生后表現出的第1次站立行為可以反映出其活力高低[15]。吮吸初乳是犢牛攝取營養的唯一途徑，初乳的攝入有利于犢牛被動免疫的建立，及時攝入初乳有利于犢牛健康，并提高犢牛存活率[16]。對于新生犢牛來說，在非人工飼喂初乳的條件下，犢牛在出生后需要自主站立，站立之后才可以盡快尋找到母牛乳頭以吮吸初乳，站立時間的早晚是影響犢牛吮吸到初乳時間的重要因素。Houwing等[17]研究發現，新生荷斯坦公犢牛第1次成功站立的時間為出生后152.2 min，嘗試了17.6次后才成功站立；新生荷斯坦母犢牛第1次成功站立的時間為出生后88.0 min，嘗試了15.4次后成功站立。Jensen[18]研究觀察到犢牛第1次嘗試站立的時間為出生后13～40 min，第1次成功站立的時間為出生后32～90 min(觀察對象包括公、母犢牛)。上述研究中均由母牛對犢牛進行哺乳，因此直接觀測了犢牛的第1次站立時間，而在當前我國的奶牛養殖生產中，一般不采用母牛哺乳犢牛的飼養方式，而是由人工及時飼喂犢牛初乳，在此期間犢牛會受到人為干擾。因此，本試驗在研究犢牛的第1次站立行為時觀測的是犢牛被轉移至犢牛舍之后無人為干預狀態下的行為表現。其中，Lick組犢牛在進入犢牛舍之后32.9 min第1次嘗試站立，成功站立所用時間為76.6 min，期間嘗試次數為5.1次；Con組犢牛進入犢牛舍之后23.8 min第1次嘗試站立，99.7 min時成功站立，期間嘗試次數為8.0次。Lidfors[19]研究發現，在出生后被母牛舔舐的犢牛第1次站立時間顯著早于未被舔舐的犢牛。本研究中也得到了相同結果，Lick組犢牛第1次站立時間早于Con組，且在成功站立之前嘗試站立的次數較少。這表明母牛的舔舐有利于促進犢牛盡快站立，提高了新生犢牛的活力。母牛的舔舐可以使犢牛被毛盡快干燥，減少熱量損失，并刺激犢牛呼吸和血液循環，這可能是導致新生犢牛活動水平較高的原因[20]。

3.2 母牛舔舐對新生犢牛采食初乳期間及前、后行為的影響

本研究中發現，相較于Con組，在產后被舔舐15～20 min的犢牛活動動機更強，當采食初乳時，被舔舐的犢牛的站立時長相對較長；且觀察到在采食初乳前后被Lick組犢牛站立、行走時長和次數較多，躺臥的時間較少，對外界環境進行探索的時間和次數也較多，這表明被舔舐的犢牛行為較為活躍。行走被認為是由犢牛自主決定的一種放松行為，探究行為則是與積極的情感狀態相聯系的一種行為，并且可以在積極情緒方面評估動物福利，一般表現出較高的探究行為動機，意味著動物感覺愉悅[21]。呂晶[22]研究發現，與受到消極情感刺激相比，犢牛在受到積極的情感刺激后表現出更多的探究行為。Lick組犢牛表現出的行走行為和探究行為較多，在一定程度上反映出了經由母牛舔舐的犢牛精神狀態可能更為積極、放松，更易于接受和適應陌生的環境條件。Li等[23]通過刷拭犢牛來模擬母牛對犢牛的舔舐行為，發現被刷拭組的犢牛較對照組犢牛行為更加活躍，表現出了更多的口部行為，同時與人員的互動也更為積極，在陌生環境中行為也更為活躍。

3.3 母牛舔舐對新生犢牛應激與免疫的影響

COR是由腎上腺皮質分泌的一種主要參與機體糖代謝調節的激素，能夠促進動物機體組織中蛋白質和脂肪的分解，是機體發生應激反應時分泌的一種維持生物體正常生理機能的激素[24]。當動物體內COR含量過高時，會導致動物的免疫力降低，出現炎癥反應[25]，因此，要盡量避免動物產生較多的COR，尤其是對于新生犢牛來說，犢牛在出生之后，生存環境經歷了巨大的轉變，由母體子宮轉變為外界自然環境，新生犢牛的各項生理機能都不完善，不易適應外界環境，會產生較大的應激反應。在分娩過程中，如果發生難產，胎兒排出期時間過長，就會造成犢牛缺氧，從而促使腎上腺皮質釋放更多的COR，加劇犢牛的應激反應[26]。本研究發現，產后被母牛舔舐的犢牛血清COR含量低于未被舔舐的犢牛，這反映出了犢牛出生之后，母牛對其進行舔舐可以降低犢牛對外界環境的應激反應。

細胞因子是免疫細胞或某些非免疫性細胞在受到抗原刺激后合成與分泌的一類小分子蛋白，具有多種生物學功能，如調節免疫應答、參與炎癥反應等。根據在炎癥反應中所發揮的作用效果，細胞因子可以分為促炎性和抗炎性2類細胞因子。IL-2和IL-4屬于抗炎性細胞因子，IL-6、IL-1β和TNF-α屬于促炎性細胞因子[27-28]。輔助性T細胞由1型輔助性T細胞(Th1)和2型輔助性T細胞(Th2)組成[29]。IL-2是具有代表性的Th1型細胞因子，對細胞介導的免疫反應至關重要，它會激活和促進T細胞的增殖和分化，以增強細胞免疫[30]。IL-6由Th2型細胞因子分泌的一種多效性促炎癥細胞因子，促進B細胞增殖分化，參與體液免疫[31]。有大量的試驗和相關研究表明免疫功能和情感、精神狀態之間存在相關關系，積極的情感刺激會對動物機體的免疫功能帶來正向的影響[32-35]。動物機體受到的情感刺激會誘導血液中一些細胞因子含量的變化，積極的情感刺激會使IL-2含量增加，TNF-α含量降低[36]。呂晶[22]對犢牛進行了食物滿足的積極刺激與食物剝奪的消極刺激，發現在積極刺激后犢牛血清中的IL-2含量增加，TNF-α含量減少。母牛對犢牛進行舔舐可以幫助犢牛被毛盡快干燥，促進犢牛的血液循環[37]。本試驗也發現了舔舐后犢牛的應激水平會降低，因此，認為母牛的舔舐對新生犢牛來說是一種積極的刺激。Stellar等[33]研究發現，積極的情感刺激和情緒與促炎性細胞因子特別是IL-6含量之間的存在著潛在生物學途徑聯系。本試驗中，在母牛對犢牛進行舔舐之后(0 h)的血清指標測定結果顯示，各血清細胞因子含量均無顯著差異，推測可能是由于犢牛剛剛出生且母牛僅舔舐了15～20 min就使犢牛離開了母牛，對犢牛的刺激強度較小，也可能是母牛舔舐對犢牛血清細胞因子含量的影響有遲后效應。本研究還發現，在被舔舐后24 h時，Lick組犢牛血清促炎性細胞因子IL-6含量顯著低于Con組，同時在行為的觀察結果中發現了Lick組犢牛的行為更為活躍，表明母牛的舔舐會對犢牛情感狀態產生積極的影響。

4 結 論

母牛對新生犢牛進行15～20 min的舔舐可以降低犢牛的應激水平，增強新生犢牛的活力，同時使得犢牛在隨后24 h內的行為更加活躍。因此，建議各牛場在母牛分娩后允許母牛對新生犢牛進行適度的舔舐。