殼寡糖對奶牛外周血單個核細胞抗氧化功能的促進作用

鄭亞光 齊敬宇 張博綦 趙艷麗 郭曉宇 史彬林 閆素梅

(內蒙古農業(yè)大學動物科學學院，呼和浩特 010018)

自由基是正常呼吸、新陳代謝和異種生物自氧化的副產物[1]。處于不同泌乳階段的奶牛經常暴露在活性氧(ROS)自由基中，由于高產奶牛具有較高的營養(yǎng)和生理代謝水平，引起一氧化氮(NO)等自由基在體內的過量積累，當機體內抗氧化劑對自由基清除不足時，多余的自由基會對細胞膜造成損害，使細胞功能發(fā)生改變，從而導致組織和器官的功能紊亂與氧化應激，并伴隨一系列疾病的產生，在奶牛中會導致乳腺炎和生殖障礙、乳房水腫、胎盤殘留、乳腺炎等，對奶牛的生產周期產生不利影響，降低產奶量和經濟價值[2]。因此，為動物補充抗氧化劑是調節(jié)抗氧化系統(tǒng)、降低氧化應激的有效途徑[3]。殼聚糖通過酸水解和酶降解方法可得到殼寡糖(COS)，它是一種由β-1,4-糖苷鍵連接的二氨基葡萄糖的低聚物，具有水溶性、無細胞毒性、容易通過腸道吸收等特點[4]。COS還被證明具有多種生物活性，包括抗炎、免疫刺激、抗氧化[5]，其理化性質與殼聚糖非常相似[6]。COS可提高細胞內過氧化氫酶(CAT)活性和谷胱甘肽(GSH)含量，表明COS在活細胞中可以作為有效的抗氧化劑[7]。一些報道指出殼聚糖及其衍生物可以提高奶牛的抗氧化功能和免疫功能[4-5]，但其影響機理尚不清楚。NO是一種通過一氧化氮合酶將L-精氨酸轉化為L-瓜氨酸的具有信號調節(jié)功能的自由基，然而，長期過量的NO生成與許多疾病有關[8]。過量的NO對奶牛乳腺上皮細胞造成了氧化損傷，并誘導了炎癥因子的產生[9]。以小鼠胰腺β細胞系MIN6為模型的研究指出，COS對過氧化氫(H2O2)誘導的氧化損傷的保護作用機制與其顯著抑制了NO的產生有關[10]。脂多糖(LPS)誘導小鼠264.7巨噬細胞氧化應激的研究表明，COS可以通過調節(jié)核因子-κB(NF-κB)信號通路和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達抑制NO的生成，緩解細胞氧化應激[11]。這些結果提示COS可以調節(jié)奶牛的抗氧化功能，其機制可能與COS通過NF-κB信號通路調節(jié)NO的生成有關。

外周血單個核細胞(PBMC)是一類重要的免疫效應細胞，能夠反映機體感染及疾病的發(fā)生，其抗氧化應激能力與奶牛的抗氧化功能和免疫功能密切相關。PBMC是抵御病原體入侵的第1道免疫防線，它通過產生炎性介質，如細胞因子和趨化因子，通過吸引其他免疫細胞到炎癥部位而有效地調節(jié)炎癥過程[12]。在奶牛上的研究表明，疾病(如口蹄疫)發(fā)生時，由PBMC釋放的NO使血清中NO含量上升[13]。本試驗以奶牛PBMC為模型，通過體外試驗研究COS對PBMC的細胞活力、抗氧化酶活性及炎癥因子含量及其基因表達的影響，進一步從體外驗證COS對奶牛PBMC抗氧化功能的調節(jié)作用，并通過檢測NO合成相關酶活性及其基因表達以及NF-κB信號通路相關基因表達，進一步探討COS對奶牛PBMC抗氧化功能的調節(jié)是否與降低了NO的生成有關。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PBMC采用Ficoll密度梯度離心法分離培養(yǎng)制備。COS，食品級，脫乙酰度≥85%，相對分子質量≤3 000，粒度≥140目，水分含量≤10%，購自濟南某生物工程有限公司。

1.2 試劑配制

COS工作液配制:準確稱取0.32 g COS，溶解在10 mL不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，配制成濃度為32 mg/mL的COS一級母液。取1 mL一級COS母液溶解于9 mL不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，配制成濃度為3.2 mg/mL的COS二級母液。取COS二級母液繼續(xù)溶解于不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，依次進行稀釋，獲得終濃度為320、160、80、40 μg/mL的工作液，母液和工作液均通過0.22 μm濾器過濾除菌。

1.3 PBMC的分離培養(yǎng)

本試驗所用到的血樣是從沙梁牧場(呼和浩特市)采集的，來自3頭健康荷斯坦奶牛[泌乳天數(200±15)d，產奶量(34.80±4.95)kg/d，胎次為3胎]，于晨飼前空腹尾靜脈采血，使用含EDTA抗凝劑的抗凝血采血管采集血液并于12 h內完成細胞的分離。PBMC分離方法根據English等[14]和Ferrante等[15]的研究進行，簡要步驟如下：使用牛PBMC分離液KIT中的稀釋液按1∶1比例對混合后的血液進行稀釋，在15 mL離心管中將稀釋后的血液按照與分離液1∶1的比例小心地加于牛PBMC分離液上方，在水平離心機(Beckman，美國)中400～500×g分離30 min，離心后由上至下分為4層，第1層為血漿層，第2層為環(huán)狀乳白色PBMC層，第3層為透明分離液層，第4層為紅細胞層。吸取第2層的細胞層并用PBS重懸清洗細胞，250×g離心10 min后棄上清，重復清洗細胞2次后，將細胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸并接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 試驗設計

本試驗采用單因素隨機試驗設計，將分離得到的PBMC隨機分為5組，進行如下處理：對照組(CON組)細胞培養(yǎng)液中不添加COS(0 μg/mL COS)；COS40、COS80、COS160和COS320組在細胞培養(yǎng)液中分別添加40、80、160和320 μg/mL的COS，每個處理6個重復。即將細胞接種于含有RPMI-1640培養(yǎng)基的25 mL細胞培養(yǎng)瓶中，使培養(yǎng)瓶中的COS的終濃度達到上述5個濃度，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)后的細胞一部分接種于96孔培養(yǎng)皿中，用于細胞活力的檢測，每個孔的接種密度為1×106個/mL；另一部分細胞直接收集細胞上清液和細胞用于后續(xù)試驗。

1.5 樣品采集

細胞上清液：將每個重復的培養(yǎng)瓶中的細胞吹打混勻后，吸取1 mL于1.5 mL無菌無酶的離心管中，水平離心機中250×g離心10 min，將細胞上清液吸取轉移至新的1.5 mL離心管內，用于抗氧化相關酶活性和炎癥因子含量的檢測。

細胞樣品的制備：繼上述培養(yǎng)瓶中細胞250×g離心10 min后，棄掉多余的上清液，在1.5 mL離心管內加入1 mL PBS重懸細胞，250×g離心10 min后棄除PBS，清洗細胞2次后，加入1 mL Trizol Plus于冰上反復吹打裂解細胞，用于后續(xù)RNA的提取。

1.6 測定指標與方法

1.6.1 細胞活力與抗氧化指標

采用CCK-8法測定奶牛PBMC的細胞活力。將根據試驗設計培養(yǎng)處理后的細胞懸液加于96孔板，每孔100 μL，細胞密度1×106個/mL，每個孔加入CCK-8 10 μL，用槍頭與細胞混勻后孵育細胞1 h左右，使用全自動酶標儀(BioTek Synergy H1，美國)測定450 nm處的吸光度(OD)值，孵育時間的長短以使對照組的OD值接近于1為宜(OD值控制在1時較為穩(wěn)定，本試驗的孵育時間為1 h)。細胞活力計算公式如下：

細胞活力=試驗組OD值/對照組OD值。

細胞上清液中CAT、SOD、GPx、TrxR的活性根據試劑盒說明書，使用全自動分光光度計(UN2CO-WFT2100，Aoyi，中國)進行檢測。

1.6.2 ROS、iNOS活性以及NO與炎癥因子含量

細胞上清液中ROS、iNOS活性以及NO、IL-1β、IL-6、TNF-α含量根據試劑盒說明書進行，使用全自動分光光度計或全自動酶標儀進行檢測。

1.6.3iNOS、炎癥因子和NF-κB信號通路相關基因表達

表1 引物信息

1.7 數據處理與分析

本試驗的數據通過Excel 2013整理計算，使用SAS 9.4軟件的GLM程序和回歸分析(線性和二次效應)程序進行分析，并采用Duncan氏多重比較法評估組間差異顯著性。當P<0.05時，表明差異具有顯著性，而當0.05≤P<0.10時表明差異具有統(tǒng)計學顯著性的趨勢，P≥0.10時表明差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 細胞活力、抗氧化酶活性和炎癥因子含量

由表2可知，各COS組的細胞活力在數值上均高于CON組，但組間差異不顯著(P≥0.10)。與CON組相比，COS80、COS160、COS320組的TrxR活性顯著升高(P<0.05)，其中以COS80組的活性最高，并顯著高于COS40組(P<0.05)；回歸分析得出，隨著COS劑量的增加，TrxR活性呈顯著的二次曲線升高(P=0.043)。SOD的活性以C160和C320組較高，趨于顯著地高于CON組(P=0.095)；回歸分析得出，SOD的活性隨COS劑量的增加呈顯著的線性升高(P=0.032)。回歸分析得出，CAT活性隨COS劑量的增加呈現顯著的二次曲線升高(P=0.013)，以COS80組的活性最高，趨于顯著地高于CON和COS320組(P=0.063)，且COS320組與CON組之間無顯著差異(P≥0.10)。

表2 COS對細胞活力、抗氧化酶活性和炎癥因子含量的影響

與CON組相比，COS40、COS80、COS160組的TNF-α含量顯著降低(P<0.05)，尤以COS160組含量最低，COS320組顯著高于COS160組(P<0.05)，但與CON組和其他COS組無顯著差異(P≥0.10)；回歸分析得出，TNF-α含量隨COS劑量的增加呈顯著的二次曲線降低(P<0.001)。COS40組NO含量顯著高于CON組(P<0.05)，COS160組的NO含量顯著低于CON組(P<0.05)，COS80、COS160、COS320組NO含量顯著低于COS40組(P<0.05)，以COS160組的含量最低；回歸分析得出，隨著COS劑量的增加，NO含量呈趨于顯著的線性降低趨勢(P=0.052)。IL-1β、IL-6含量隨COS劑量的增加先下降后上升，COS40和COS80組IL-1β含量趨于顯著地低于COS320組(P=0.058)，COS80組IL-6含量趨于顯著地低于COS320組(P=0.090)；回歸分析得出，隨著COS劑量的增加，IL-1β含量呈趨于顯著的二次曲線降低趨勢(P=0.073)，IL-6含量呈趨于顯著的線性降低趨勢(P=0.068)。ROS活性隨COS劑量的增加而下降，但各組間差異不顯著(P≥0.10)。與CON組相比，COS80、COS160和COS320組的iNOS活性顯著降低(P<0.05)，其中以COS160組最低；回歸分析得出，隨著COS劑量的增加，iNOS活性呈顯著的二次曲線上升(P=0.005)。COS劑量對GPx活性沒有產生顯著影響(P=0.399)。

2.2 iNOS、炎癥因子和NF-κB信號通路的基因表達

由表3可知，與CON組相比，各COS組NF-κBp50和NF-κBp65的mRNA相對表達量均顯著下降(P<0.05)，其中NF-κBp50的mRNA相對表達量以COS160、COS320組較低，NF-κBp65的mRNA相對表達量以COS160組最低；回歸分析得出，隨著COS劑量的增加，NF-κBp50的mRNA相對表達量呈顯著的線性下降(P<0.001)，NF-κBp65的mRNA相對表達量呈顯著的二次曲線降低(P<0.001)。COS40、COS80和COS160組iNOS的mRNA相對表達量顯著低于CON組(P<0.05)，但COS320組顯著高于CON組和其他COS組(P<0.05)。COS80和COS160組TNF-α的mRNA相對表達量顯著低于CON、COS40和COS320組(P<0.05)，CON、COS40和COS320組之間無顯著差異(P≥0.10)；回歸分析得出，iNOS和TNF-α的mRNA相對表達量均隨COS劑量的增加呈顯著的二次曲線降低(P<0.001)。IL-1β的mRNA相對表達量隨COS劑量的增加先降低后升高，其中以COS80組最低且趨于顯著地低于COS320組(P=0.088)，但與CON組相比無顯著差異(P≥0.10)；回歸分析得出，IL-1β的mRNA相對表達量隨COS劑量的增加呈趨于顯著的二次曲線降低趨勢(P=0.060)。

表3 COS對iNOS、炎癥因子和NF-κB信號通路相關基因mRNA相對表達量的影響

3 討 論

3.1 體外添加COS對奶牛PBMC抗氧化功能和炎癥因子的調節(jié)作用

PBMC包括淋巴細胞和單核細胞，是機體主要的血液免疫細胞，能夠反映機體感染及疾病的發(fā)生，其抗氧化應激能力與奶牛的抗氧化功能和免疫功能密切相關。通常，內源性抗氧化劑包括SOD、GPx、CAT和TrxR在內的酶抗氧化劑，是細胞內抗氧化防御的主要形式。SOD催化超氧陰離子歧化為H2O2和氧分子(O2)，因此使?jié)撛谟泻Φ某蹶庪x子的危害性降低；GPx可將H2O2分解為水[16]，血漿GPx活性與脂質過氧化物含量有關；CAT是一種常見的抗氧化酶，幾乎存在于所有利用氧氣的活組織中，催化H2O2還原為水和O2；TrxR組成了硫氧還蛋白(Trx)系統(tǒng)，是重要的抗氧系統(tǒng)[17]。根據本試驗結果，體外PBMC中添加COS對TrxR、CAT和SOD活性的促進作用呈二次曲線劑量依賴效應，其中以COS80和COS160組效果較好；而COS320組CAT活性與COS160組相比有降低趨勢，與CON組相近，說明COS對奶牛PBMC的抗氧化相關指標的促進作用呈劑量依賴性。已有體內試驗指出，在大鼠飼糧中添加COS可以提高SOD、CAT、GPx活性和總抗氧化能力(T-AOC)，降低血清、肝臟、脾臟中的丙二醛(MDA)含量，通過減輕脂質過氧化和恢復抗氧化能力，保護大鼠免受H2O2的損傷[18]。本試驗從體外印證了COS可提高PBMC的抗氧化功能。

在PBMC中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子含量的高低可以反映細胞的炎癥反應，受到如LPS等刺激后，IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子會大量產生引起炎癥反應[19]。本試驗中IL-1β、TNF-α和NO的含量及其基因的mRNA相對表達量隨著COS劑量的增加呈顯著或趨于顯著的二次曲線降低，其中以COS160組的含量最低，IL-6的含量也有下降的趨勢，說明COS在改善奶牛PBMC抗氧化功能的同時，對炎癥因子的產生也具有劑量依賴性的抑制作用，COS320組對炎癥因子的產生沒有表現出顯著的抑制作用。

3.2 COS促進奶牛PBMC抗氧化和降低炎癥反應的機理

在炎癥過程中，乳腺的巨噬細胞和上皮細胞產生大量的NO在乳腺炎期間介導炎癥，過量釋放的NO會對奶牛的組織器官(如乳腺等)造成氧化損傷[20]。有研究表明，體外刺激小鼠巨噬細胞時，iNOS的表達增強，會導致NO、TNF-α和白細胞介素(IL)大量產生[21]。iNOS的表達受轉錄因子NF-κB信號通路的調控，在正常細胞中，胞漿中的NF-κB信號通路是非活性的，由蛋白二聚體(p65/p50)和NF-κB抑制蛋白(IκB)抑制劑組成[22]，NF-κB信號通路一旦被激活，p65/p50二聚體可以遷移到細胞核中，啟動炎癥因子如IL-1β、TNF-α和iNOS等相關基因的轉錄，促進NO大量生成[23]。有體內試驗也表明，殼聚糖可通過NO分子途徑發(fā)揮免疫調節(jié)功能[24]。本試驗中，通過對NF-κBp50和NF-κBp65基因表達的檢測發(fā)現，體外添加COS對奶牛PBMC的NF-κB信號通路具有抑制作用，并呈現線性劑量依賴效應，與CON組相比，各COS組中iNOS活性及其基因的mRNA相對表達量及NO的含量均隨COS劑量的增加先降低后升高，其中COS160組最低，COS320組出現升高趨勢，表明COS可以在一定范圍內對奶牛PBMC中iNOS的表達具有抑制作用，并降低NO的產生；同時，免疫因子IL-1β和TNF-α的mRNA相對表達量也隨COS劑量的增加呈下降趨勢。這提示，COS提高PBMC的抗氧化功能，抑制炎癥反應的反生，可能與其對NF-κB信號通路活性的抑制降低了NO的生成有關。有研究指出，低分子質量的硫酸化殼寡糖可抑制LPS誘導導致的NO、IL-6和TNF-α等炎性介質的產生，并通過NF-κB信號通路活化絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路，抑制LPS誘導的RAW264.7細胞的巨噬細胞中IL-6和TNF-α的產生[25]，因此，今后可從MAPK信號通路進一步探討COS影響PBMC抗氧化功能與炎癥因子產生的機理。

4 結 論

體外添加COS對奶牛PBMC抗氧化功能的促進作用及其對炎癥因子產生的抑制作用呈劑量效應，其中以160 μg/mL COS的效果較好，但320 μg/mL COS對炎癥因子產生的抑制作用減弱；COS抑制了NF-κBp50和NF-κBp65的基因表達，COS可能通過抑制NF-κB信號通路活性，降低iNOS與炎癥因子IL-1β和TNF-α的基因表達，降低NO的生成，進而提高抗氧化應激能力。