基于轉錄組測序分析研究枸芪多糖對育肥豬腸黏膜免疫功能的作用機理

霍金金 褚耀誠 金 娜 李 禎 郝 壯 陳長增 李建東 劉鳳華*

(1.北京農學院動物科學技術學院，北京 102206；2.河北北方學院動物科技學院，張家口 075000)

腸道作為動物發揮免疫調節作用的重要場所，與動物機體的健康息息相關，是機體最大的免疫器官。腸道黏膜可以有效阻止細菌或毒素等生物化學物質進入細胞，是機體天然的免疫屏障[1]，腸道黏膜系統受損會導致機體內環境紊亂、組織損傷和病理變化，增加疾病的發生[2]。枸芪多糖主要由枸杞、黃芪等天然植物經干燥提煉后配伍而成，具有安全無害、無抗藥性、無殘留、加工工藝簡便等特點[3]。黃芪主要含皂苷、黃酮類化合物、多糖等成分，具有改善動物生產性能、增強機體免疫、抗病毒、抗細菌感染、抗炎癥和抗癌癥等功能[4-6]。枸杞的主要營養和功能成分有多糖、維生素、氨基酸等，具有抗氧化、免疫調節、抗炎抗癌等作用[7-9]。研究發現，黃芪多糖不僅能夠有效促進仔豬的生長發育，還能提高其免疫力，增強細胞免疫功能[10]。在肉雞養殖中添加枸杞多糖能夠提高其脾臟、法氏囊、胸腺的白細胞介素-2(IL-2)和白細胞介素-6(IL-6)的基因相對表達水平，促進機體的正常代謝，提高肉雞的免疫力[11]。枸杞多糖對免疫抑制小鼠具有免疫增強作用，可調節腸道黏膜免疫系統[12]。黃芪多糖和復方多糖可促進雞免疫器官的生長發育，提高機體的免疫功能[13]。黃芪多糖和枸杞多糖也是增強T細胞功能的免疫增強劑[14-16]。Chen等[16]研究表明，粗多糖可以提高動物的免疫力，其中最有效的方式是刺激轉錄因子中的活化T細胞核因子(NFAT)和刺激蛋白-1(AP-1)，抵抗機體的炎癥反應，阻擋病原體造成的感染，從而得到提高免疫能力的目的。

本項目組前期研究發現，枸芪多糖可有效提高育肥豬的生長性能，降低腹瀉率，改善腸道形態和菌群結構[17-18]，這些變化與腸黏膜免疫有著很大關聯，但關于把枸杞和黃芪提煉為枸芪多糖探究其對育肥豬腸道免疫的潛在分子機制的影響尚不明確。鑒此，本研究進一步研究枸芪多糖對育肥豬腸黏膜免疫功能的作用機理，以期為枸芪多糖在育肥豬生產中的應用提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

枸芪多糖為本實驗室自制，枸杞與黃芪1∶1混合后取1 500 g，加10倍量的水煎煮、干燥，加淀粉至900 g，粉碎，混勻，經提取、濃縮、干燥后制得，每克枸芪中提取的復合多糖含量為106 mg。

1.2 試驗動物與試驗設計

選用80～90日齡、初始體重為(50±3)kg、血緣和胎次相近的健康杜×長×大三元雜交育肥母豬180頭，隨機分成對照組和試驗組，每組6個重復，每個重復15頭豬。對照組飼喂基礎飼糧，試驗組在基礎飼糧中添加0.1%枸芪多糖，試驗期90 d。基礎飼糧組成及營養水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(干物質基礎)

1.3 飼養管理

試驗開始前對豬舍及料槽、水槽全面消毒，試驗豬分欄飼養，按常規免疫程序進行免疫和驅蟲，自由采食和飲水。

1.4 樣品采集與處理

1.4.1 空腸組織總RNA提取

試驗結束后，從每組隨機選取3頭育肥豬進行屠宰，迅速剪取3 cm左右的空腸腸段，沖洗后裝入5 mL的無菌離心管中，立即放入液氮中保存待檢，并嚴格按照總RNA提取試劑盒說明書對樣品中總RNA進行抽提。

1.4.2 建庫測序與分析

根據HiSeq平臺，采用Illumina TruseqTMRNA sample prep Kit方法進行文庫構建。利用帶有Oligo(dT)的磁珠與ploy A進行A-T堿基配對，富集mRNA。將富集得到的mRNA隨機打斷成300 bp左右的小片段，再以mRNA為模板反轉錄成cDNA，合成穩定的雙鏈結構，在3’末端加上一個A堿基，連接Y字形的接頭，對連接adapter后的產物進行純化和片段分選，用分選產物進行PCR擴增，純化得到最終的文庫。Illumina HiSeq X10上機測序。用Trim Galore軟件對原始測序數據(raw reads)進行過濾得到高質量有效讀段數據(clean reads)，利用HISAT2軟件將clean reads與豬的參考基因組比對，將比對成功的clean reads組裝成Unigene，然后分析基因表達量。

1.4.3 轉錄組測序差異表達基因的實時熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證

選擇同批次的RNA樣本進行qRT-PCR驗證，驗證測序結果的可靠性。總RNA樣品經反轉錄后，用TIANGEN的SYBR Green試劑盒進行基因表達熒光定量分析，反應體系共20 μL：1 μL cDNA，上、下游引物各1 μL，6.7 μL 經焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的滅菌蒸餾水，10 μL SuperReal PreMix Plus，0.3 μL ROX Reference Dye。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環35次，用2-ΔΔCt法分析。qRT-PCR所用基因引物序列見表2。

表2 基因引物序列

1.4.4 蛋白免疫印跡(western blot)檢測信號通路

將提取的組織勻漿液于4 ℃、12 000×g離心5 min后取上清液即為全蛋白溶液。將提取的蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(上樣量為15 μg)，將蛋白轉移至硝酸纖維素(NC)膜，封閉2 h后，進行孵育，一抗孵育2 h，二抗孵育40 min，利用Odyssey成像系統掃描NC膜，分析結果。

1.5 數據處理與分析

數據采用SPSS 16.0軟件進行處理，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)并進行組間差異顯著性比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 測序數據統計

通過Illumina HiSeq X10平臺得到轉錄組測序數據，6個樣本的clean reads條數從51 700 340到58 609 640，共得到329 895 374條clean reads(表3)，可以定位到豬基因組上的clean reads數占84%以上，在參考序列上有唯一比對位置的序列數占比為76%～79%，有多個比對位置的序列數占7.0%～8.5%，各個樣本定位到參考基因組不同區域的分布比例相似，75.99%～78.02%定位到編碼區(CDS)，其余依次定位到3′端非編碼區、基因間區、內含子區和5′端非編碼區。

表3 育肥豬空腸組織轉錄組測序數據

2.2 差異表達免疫基因

轉錄組測序數據顯示，以P-adjust<0.05，|log2FC|≥0.75為篩選條件，共鑒定出試驗組相對對照組有479個基因發生顯著變化，其中免疫基因有75個發生顯著變化，包括26個基因表達上調，以及49個基因表達下調(表4)。對表達水平相似的差異基因進行層級聚類分析，構建聚類熱圖(圖1)，從圖中可清晰地看出不同基因的表達量情況。聚類熱圖中，顏色越紅表示表達量越高，顏色越藍表示表達量越低。

C1:對照組樣本1；C2：對照組樣本2；C3：對照組樣本3；T1：試驗組樣本1；T2：試驗組樣本2；T3：試驗組樣本3。

表4 75個差異表達免疫基因

2.3 差異表達免疫基因的生物功能分析

為了探究差異表達免疫基因與表型之間的關系，將全部差異顯著的免疫基因進行基因本體(GO)富集和信號通路(pathway)分析，發現2組間存在差異的生物學過程。GO富集分析結果如圖2所示，差異表達基因主要在免疫效應過程、免疫調節、免疫應答和應激反應等生物學過程有較高的富集值。信號通路分析結果如圖3所示，差異表達基因主要在白細胞介素-17(IL-17)信號通路、NOD樣受體(NLR)信號通路有較高的富集值，說明這2個信號通路作為差異調控腸道變化的主要靶信號通路。

圖2 差異表達免疫基因GO富集分析

圖3 差異表達免疫基因信號通路分析

將差異表達免疫基因與其相關生物學功能形成基因網絡圖(圖4)，發現原癌基因Jun(JUN)和原癌基因Fos(FOS)是其中2個最關鍵的差異基因，JUN和FOS基因表達產物Jun和Fos蛋白組成的二聚體復合物AP-1是細胞核內重要的轉錄因子，可以接收細胞外界刺激信號進而調節下游基因。結合之前的GO富集發現，基因網絡圖的節點位置很多蛋白都與免疫相關，除了JUN和FOS，白細胞介素-18(IL-18)、脂肪酸結合蛋白1(FABP1)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、趨化因子配體16(CXCL16)、補體5(C5)、補體C5a受體1(C5AR1)、谷胱甘肽過氧化物酶2(GPX2)、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP9)基因也是關鍵的差異基因(表5)，主要參與免疫應答、體液免疫、DNA損傷、抗氧化損傷修復和細胞凋亡過程，這些基因的表達在枸芪多糖作用于機體后調控腸道免疫功能方面起到了重要作用。

表5 關鍵免疫基因

圖4 差異表達免疫基因網絡圖

2.4 差異表達免疫基因的qRT-PCR驗證

為了驗證轉錄組測序的準確性，對JUN、FOS、C5和IL-18這4個差異基因進行qRT-PCR驗證，圖5結果表明，結果與轉錄組數據結果趨勢一致，說明轉錄組測序數據具有可靠性。

數據柱形標注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.5 Jun和Fos的Western Blot分析

通過轉錄組分析得到JUN和FOS是2個腸黏膜差異表達的關鍵基因，在試驗組中表達下調。Western Blot證實試驗組的Jun和Fos蛋白表達水平明顯低于對照組(圖6)，灰度分析見圖7，結果均顯示Jun和Fos蛋白表達水平顯著低于對照組(P<0.05)，其結果和聚類熱圖結果相符合。

圖6 Jun和Fos的Western Blot驗證

圖7 定量驗證Jun和Fos表達水平

3 討 論

腸道是機體最大的免疫器官，具有消化吸收、排毒、強化免疫等生物學功能，機體自身的免疫力、飼糧結構等均會直接影響腸道功能的正常運作[19]。已有相關轉錄組測序研究得出，一些差異表達基因與免疫力有關[20-21]。本文采用轉錄組測序技術，通過枸芪多糖組和對照組免疫基因比較分析，發現共有75個差異基因發生顯著變化，26個基因顯著上調，49個基因顯著下調，基因的上調和下調影響著一些表達蛋白和因子分泌發生變化，通過一系列的信號通路過程最終對機體產生重要影響。

通過GO富集發現差異基因主要參與免疫調節、免疫應答和應激反應，信號通路分析發現免疫基因表達主要集中在IL-17信號通路和NOD樣受體信號通路，這2個信號通路作為差異調控腸道變化的主要靶信號通路。將差異免疫基因與其相關生物學功能形成基因網絡圖，發現JUN、FOS、IL-18、FABP1、MMP9、CXCL16、C5、C5aR1、GPX2、PARP9的基因表達情況差異極顯著，差異免疫基因與其相關生物學功能形成基因網絡圖，顯示JUN和FOS是其中2個最關鍵的差異基因。

炎癥相關差異表達的重要基因JUN和FOS，在參與機體的免疫應答方面有著重要的影響，Jun蛋白和Fos蛋白組成的二聚體復合物AP-1是細胞核內重要的堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子，以磷酸化的c-JUN/c-FOS形式與基因序列上的AP-1結合位點結合[22]。在炎癥、腫瘤發生時AP-1是調節炎癥因子表達的重要轉錄因子[23]，是IL-17信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路和c-Jun N端激酶(JNK)通路等炎癥信號通路的下游信號因子。當受到上游信號刺激后下游因子被激活，后續引發一系列鏈式反應，從而使得炎癥反應發生。當機體受到刺激，AP-1接收到上游信號被激活后，會由胞漿進入到胞核中，使炎癥因子發生轉錄[24]。本試驗發現枸芪多糖使Jun蛋白和Fos蛋白表達明顯降低，表明枸芪多糖組的炎癥反應受到抑制，AP-1沒有被激活，未使炎癥因子發生轉錄，使得通路未被激活。炎癥因子通常作為免疫調節的生物標記，炎癥過程是先天性免疫反應的重要組成部分，這也說明枸芪多糖可以通過調控炎癥因子的激活，調節白細胞介素和趨化因子的表達來發揮抗炎作用，調節腸道免疫功能。JUN、FOS、IL-18、FABP1、MMP9、CXCL16、C5、C5aR1、GPX2、PARP9這些基因主要富集在IL-17信號通路、NOD樣受體信號通路，故推測枸芪多糖可能通過作用于IL-17信號通路、NOD樣受體信號通路抑制AP-1入核調控炎癥相關基因的轉錄，抑制炎癥因子發生，從而對育肥豬腸道進行免疫保護。

Okamura等[25]發現，IL-18是白細胞介素-1(IL-1)家族蛋白中的一員，作為促炎因子的IL-18在一些疾病發生中顯著表達，如腫瘤、胃腸疾病、動脈粥樣硬化等。本試驗發現，枸芪多糖使IL-18的基因表達被抑制。補體系統是體液免疫的重要組成部分，被激活后發揮調理吞噬、介導炎癥、免疫調節及清除免疫復合物等多種生物學效應。C5是補體系統的重要組成成分，研究表明，C5參與體液免疫，補體系統在炎癥和抗感染中發揮重要作用[26]。本試驗中，飼糧中添加枸芪多糖育肥豬體內C5表達水平顯著增加，表明枸芪多糖可增強機體補體系統，進而增強腸道黏膜免疫力。

4 結 論

本試驗通過轉錄組分析，在飼糧中添加枸芪多糖能夠增強肥育豬腸黏膜免疫功能，枸芪多糖可能通過調節JUN、FOS、IL-18等免疫相關基因的表達，影響IL-17和NOD樣受體信號通路，以此來抑制炎癥反應。