玉米RNA對小鼠脂肪沉積的影響

黎 夢 魏立民 陳 婷 何家建 習欠云 張 瑾 張永亮*

(1.嘉興學院生物與化學工程學院，嘉興 314000；2.華南農業大學動物科學學院，廣州 510642)

肥胖是體內脂肪過度沉積的表現，與脂代謝紊亂密切相關。脂肪代謝的紊亂會引起脂肪細胞分泌因子的異常，炎癥因子的分泌隨之增高，從而引起機體的代謝疾病以及炎癥反應[1]。肥胖人群中糖尿病、高血壓、高血脂、心腦血管疾病以及一些癌癥的發病率也顯著高于普通人群。因此，對脂肪代謝調控的研究有助于預防和治療肥胖及其引起的疾病。在畜禽生產中，肉品質更是人們關注的問題。脂肪作為影響肉品質的重要因素之一，其代謝調控的研究也可為肉品質的控制提供依據[2]。

脂肪組織的發育及調控受遺傳、營養和環境等許多因素影響。核酸是一類具有生理生化功能的營養物質，其對機體調節作用早已為人們所關注。在機體生長發育過程中，可利用外源核苷酸或核苷酸片段合成新的核苷酸供機體使用[3]。食品中的核苷酸有助于抗腹瀉和改善營養不良[4]。口服特定基因的RNA可以調節基因的表達，有助于增加小鼠骨骼肌發育[5]。減少飼糧中玉米RNA可以增加小鼠體重，單獨灌服特定的玉米miRNA可以顯著降低小鼠的增重[6]，研究也證實了玉米miRNA可通過調節動物基因的表達參與機體調節[6-7]。但植物源核酸對脂肪的調節仍鮮有報道。因此，探究植物源核酸對脂肪代謝的調節作用，對了解植物源核酸的作用機制以及通過核酸類制劑進行疾病的治療或提高畜產品品質等有積極意義。本試驗通過給斷奶小鼠灌服玉米RNA，探究其對脂肪代謝的調節，及對小鼠脂肪沉積和生長的影響，為植物源核酸調控動物脂肪沉積影響因素的探索提供新證據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計及飼糧

選取20只28日齡斷奶的C57BL/6J小鼠隨機分為2組，對照組灌服生理鹽水，試驗組灌服玉米RNA(100 μg/d)，每組10個重復(公母各占1/2)，每個重復1只，單籠飼養，進行12 h的光/暗循環。試驗期4周。

每天提取3 g玉米的總RNA，將純化的100 μg玉米RNA溶于300 μL生理鹽水，并以300 μL生理鹽水為對照，于每天08:00進行灌服。參考常規小鼠飼糧配方，將玉米淀粉代替飼糧中的玉米并保證飼糧與常規小鼠飼糧營養和能量均衡[7]，配制成低玉米RNA飼糧進行飼喂，飼糧組成及營養水平見表1。

表1 飼糧組成及營養水平(干物質基礎)

試驗結束后檢測小鼠抓握力，曠場試驗檢測焦慮情況，使用核磁共振成像儀(上海紐邁電子科技有限公司，MesoQMR23-060H)測定小鼠的體組成及體成像，最后小鼠采用斷頸處死并按步驟采集樣品。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 生長性能測定

試驗小鼠每周稱重(08:00，空腹)，計算每周及全期平均日增重；記錄喂料量和余料量，計算各階段及全期平均日采食量和累積采食量。

1.2.2 血清生化指標測定

在試驗結束時，每組10只小鼠分別采集全血，室溫傾斜靜止1 h，室溫條件下4 000 r/min離心10 min獲取血清，-20 ℃保存備用。用全自動生化分析儀(美國貝克曼，AU5800)及中生北控試劑盒測定血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、尿素(UREA)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量、白蛋白/球蛋白(A/G)及丙氨酸氨基轉移酶(ALT)活性。

1.2.3 器官指數測定

小鼠頸部脫臼處死后，開腹分離完整干凈的脾臟、心臟、肝臟、肺臟、腎臟、皮下脂肪和附睪脂肪等組織，分別進行稱重，計算器官指數：

器官指數(%)=(器官重量/體重)×100。

1.2.4 曠場試驗

曠場試驗箱為1個100 cm×100 cm×50 cm的箱體，箱底畫有25個相等的方格。曠場試驗進行3 min，將小鼠置于試驗箱中央格內，觀察并記錄其在總區域的活動距離、中心區域的活動距離、中心時間比、平均速度、位于中心次數和直立次數。

1.2.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)測定

利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取玉米RNA，Trizol裂解法提取動物RNA。參照TaKaRa反轉錄試劑盒說明書將1 μg RNA以10 μL體系進行反轉錄，加40 μL水稀釋備用。采用熒光定量PCR儀(美國伯樂，CFX96)檢測附睪脂肪β-肌動蛋白(β-actin)、CCAAT增強子結合蛋白-α(C/EBP-α)、過氧化物酶體增殖劑激活受體-γ(PPAR-γ)、脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)、激素敏感脂酶(HSL)和脂肪酸合成酶(FAS)mRNA相對表達量，反應體系為：cDNA 2 μL，10× Taq Polymerase Buffer 2 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL，上游引物(10 μmol/L)0.4 μL，下游引物(10 μmol/L)0.4 μL，Taq Polymerase(5 U/μL)0.5 μL，加ddH2O補到20 μL；反應程序為：預變性 95 ℃ 2 min；變性95 ℃ 15 s，退火15 s，延伸72 ℃ 40 s，40個循環；最后95 ℃ 1 min，退火 30 s，95 ℃ 30 s，繪制相應的熔解曲線，反應設立無模板反轉錄樣品為陰性對照(NTC)。以β-actin為內參基因，按照2-△△Ct法計算目的基因mRNA相對表達量，引物信息見表2。

表2 qRT-PCR特異性引物

1.3 統計與分析

本試驗數據使用SPSS 17.0的one-way ANOVA程序進行方差分析，2組間采用t檢驗(t-test)進行比較，使用GraphPad 6.0制圖，以P<0.05為顯著性標準，P<0.01為差異極顯著性標準。

2 結果與分析

2.1 玉米RNA對小鼠生長性能的影響

與對照組相比，在第1～2周，試驗組小鼠累積采食量極顯著上調(P<0.01)，試驗結束時保持一致(圖1-A)，平均日采食量無顯著變化(圖1-B，P>0.05)；在第2～4周，試驗組小鼠的體重顯著低于對照組(圖1-C，P<0.05)，平均日增重有下降趨勢(圖1-D，P>0.05)。結果表明，灌服玉米RNA使小鼠增重減少。

*：P<0.05；**：P<0.01。下表同。

為探究玉米RNA對小鼠精神的影響，采用曠場試驗檢測小鼠的自主行為和焦慮情況。如圖2所示，與對照組相比，灌服玉米RNA后，小鼠運動距離、中央區域運動距離和時間、進入中心次數、速度和直立次數均無顯著差異(P>0.05)，提示玉米RNA對小鼠的自主行為活動和焦慮狀況無顯著影響，排除了產生焦慮對小鼠采食和能量代謝造成的影響而導致小鼠增重的減少。

圖2 玉米RNA對小鼠精神的影響

2.2 玉米RNA對小鼠血清生化指標的影響

如圖3所示，與對照組相比，試驗組血清ALB、TP、尿素含量、A/G、ALT活性無顯著差異(P>0.05)，提示玉米RNA對小鼠肝功能和蛋白質代謝無明顯影響；試驗組小鼠血清GLB含量顯著增加(P<0.05)，HDL-C、LDL-C和TC含量極顯著增加(P<0.01)，即玉米RNA提高小鼠血脂水平，提示脂肪代謝增強。

圖3 玉米RNA對小鼠血清生化指標的影響

2.3 玉米RNA對小鼠脂肪沉積的影響

如圖4所示，與對照組相比，試驗組小鼠相對肌肉含量極顯著增加(P<0.01)，檢測小鼠的肌肉抓握力，并無顯著差異(P>0.05)，表明灌服玉米RNA對肌肉力量無顯著影響。試驗組小鼠相對脂肪含量下降，并對小鼠進行體成像分析發現，試驗組小鼠相對脂肪含量明顯減少，且附睪脂肪指數顯著降低(P<0.05)，提示玉米RNA減少小鼠脂肪沉積。

圖4 玉米RNA對小鼠脂肪沉積的影響

2.4 玉米RNA對小鼠脂肪相關基因mRNA相對表達量的影響

如圖5所示，與對照組相比，玉米RNA能極顯著上調脂肪合成基因C/EBP-α、FASmRNA相對表達量(P<0.01)及顯著上調PPAR-γ mRNA相對表達量(P<0.05)；同時顯著上調脂肪分解基因ATGL和HSLmRNA相對表達量(P<0.05)。結果表明玉米RNA能同時增加小鼠脂肪合成代謝和分解代謝。

圖5 玉米RNA對小鼠脂肪相關基因mRNA相對表達量的影響

3 討 論

脂肪的合成與分解始終處于一種動態的平衡狀態，脂肪合成的同時也發生脂解作用，共同調節脂肪代謝。這個過程受到許多關鍵基因的調節，PPAR-γ、FAS和C/EBP-α等是參與脂肪細胞分化和脂肪酸合成關鍵的促進因子，是成脂標志性基因[8]；ATGL和HSL是負責分解脂肪組織中TG釋放游離脂肪酸的關鍵酶[9]。試驗結果顯示，玉米RNA促進附睪脂肪C/EBP-α、PPAR-γ、FAS、HSL和ATGLmRNA相對表達量，即同時促進機體脂肪的分解代謝和合成代謝。在白色脂肪中，脂質的合成與分解效率直接呈正相關[10]。在脂肪細胞分化早期和中期階段，脂肪合成相關基因PPAR-γ、LPL和FAS等的表達量依次明顯增高，細胞內的脂質合成加速，且HSL和ATGL的表達也會隨之提高，細胞內脂肪分解也開始變得活躍[11]。通過節食或鍛煉使體重下降，其HSL表達也隨之下降，脂肪分解減少[12]。特異性敲除小鼠脂肪細胞的ATGL基因，在抑制脂解和降低血脂的同時，與脂肪合成相關基因表達也受到抑制[13]。當脂肪積累超出負荷，脂質分解會增加，引起游離脂肪酸升高、高甘油三酯血癥，使人體糖脂代謝紊亂。因此在脂肪細胞減少脂質合成的同時，減少脂解更有利于維持更健康的能量代謝平衡。相應地，灌服玉米RNA促進脂解增加，同時適當的促進脂質合成增加，更有利于維持機體脂代謝的平衡。

核酸吸收、分布、代謝和清除的差異性以及不同的飲食攝入都會導致發揮作用的核酸攝入濃度的不同。研究表明，小腸RNA可酶解產生單獨一種核苷酸、核苷和堿基的產物，灌服40 μg小腸RNA能修復輻射造成的腸腺損傷[14]。飼喂80 μg大米RNA能顯著提高小鼠血清中的MIR168a的含量，并抑制靶基因低密度脂蛋白受體的表達；單獨灌服3×10-10mol MIR168a能抑制小鼠肝臟低密度脂蛋白受體的表達，增加料重比[15]。用金銀花熬制成水(MIR2911約6×10-13mol/g，濃度為1.2×10-10mol/L)飼喂小鼠能恢復因流感病毒造成的體重減輕[16]。本試驗每天灌服3 g玉米提取的100 μg RNA，證實玉米RNA可以調節脂肪代謝，可作為控制脂肪沉積的有效成分。因此，推測在正常生理狀態下，玉米RNA可以減少小鼠增重，合理控制體重；過度肥胖時，一定劑量范圍內增加玉米RNA能減少脂肪沉積，減少體重。體重變化會涉及多方面的代謝及生理生化的調節，包括消化生理、器官形態及血液生化指標等[17]。試驗組小鼠增重顯著減少，呈現持續平穩的增長狀態，平均日采食量和平均日增重無顯著差異，表明其對攝食及消化吸收無顯著影響；心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和胃的器官指數無明顯異常；曠場試驗顯示小鼠未出現焦慮狀況，且血清生化指標顯示小鼠的血清ALB、TP含量、A/G和ALT活性無顯著差異，即小鼠肝功能正常，血清尿素含量無異常，即蛋白質代謝正常，表明玉米RNA對小鼠無明顯有害影響。血清中HDL-C、LDL-C和TC含量顯著增加，即脂代謝增強，體組成、體成像和附睪脂肪指數結果顯示小鼠相對肌肉含量顯著增加，內臟脂肪沉積明顯減少。這些結果表明玉米RNA對小鼠無明顯有害影響，能增強機體脂肪代謝，減少脂肪沉積。

RNA進入腸道可被各種酶降解為單核苷酸，最終被腸道內的堿性磷酸酶和核苷酸酶水解為核苷和磷酸，部分核苷可在核苷酶的作用下被進一步降解為游離的嘌呤或嘧啶堿基，供機體利用[18]。進入機體的核苷酸如腺嘌呤核苷酸(AMP)能刺激AMP激活的蛋白激酶(AMPK)調控能量和底物代謝，并通過刺激產生ATP抑制脂肪沉積[19]。不同的核苷酸對不同的脂肪組織功能不同，0.1%復合核苷酸能降低肝臟脂肪含量同時提高肌肉脂肪含量[20]。此外，RNA寡核苷酸藥物已被開發為藥物針進行疾病治療。口服30 mg/kg特異性靶向Forkhead box O1(Foxo-1)的2’-O-甲基修飾的反義RNA寡核苷酸，可以顯著抑制Foxo-1基因的表達及肌肉的重量[5]。玉米mRNA可能通過降解產生的短片段核酸或核苷酸調節脂肪的沉積。

RNA中的許多非編碼RNA具有一定的穩定性，如siRNA[21]和miRNA[21]等具有2’-O-甲基化修飾，circRNA具有穩定的閉環結構[22]，利于其吸收并發揮作用。動物miRNA廣泛參與脂肪代謝的調節[23]。Sun等[24]報道lncRNA對脂肪代謝的調控作用，后有研究進一步挖掘和分析豬的9個組織，發現了147個脂肪circRNA[25]，表明這些非編碼RNA可能參與脂肪代謝的調控。研究表明，植物源功能性核酸miRNA可以跨界調節動物的生理過程[15-16]，且在豬的包括脂肪在內的12個組織中檢測到的18個玉米miRNA，均有不同程度的表達[26]，提示玉米功能性RNA有可能被機體吸收調節脂肪的沉積。這些植物來源功能性RNA對于脂肪的調節有待進一步研究。盡管外源性RNA跨界調控作用仍然存在爭議[27]，研究存在極大的挑戰，但是外源核酸通訊仍是目前研究的一個新的重要領域，具有廣闊的前景。這一領域的突破進展將對于人類疾病和生活的影響具有重要的意義。

4 結 論

綜上所述，玉米RNA在不影響小鼠正常生長的情況下能提高脂肪合成基因FAS、C/EBP-α、PPAR-γ和脂肪分解基因ATGL、HSL的mRNA相對表達量，增強機體脂肪代謝；脂肪分解作用大于合成作用，使脂肪沉積減少，增重減少。