不同來源蝦青素對虹鱒生長性能、肉色和抗氧化能力的影響

張春燕 文登鑫 姚文祥 李小勤 吳世林 冷向軍*

(1.上海海洋大學水產與生命學院，水產科學國家級教學示范中心，上海 201306；2.上海海洋大學水產與生命學院，農業部魚類營養與環境生態研究中心，上海 201306；3.上海海洋大學水產與生命學院，水產動物遺傳育種中心上海市協同創新中心，上海 201306；4.廣州智特奇生物科技有限公司，廣州 510663)

近年來，虹鱒(Oncorhynchusmykiss)在我國的養殖發展迅猛，至2019年養殖產量已達到3.937萬t，是我國重要的冷水性經濟魚類。虹鱒的肌肉紅度值是市場評價其品質的一個重要標準，生產中往往會通過外源添加蝦青素的方式改善虹鱒肌肉色澤。目前，生產上使用的蝦青素主要為合成蝦青素(Ast)，其成本占飼料總成本的10%～20%[1]。Ast由于存在不同立體異構性以及可能的合成中間體的殘留，故其安全性問題一直存在爭論。天然來源的蝦青素有雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)[2]、紅法夫酵母(Phaffiarhodozyma)[3]、鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)[4]、小球藻(Chlorellazofingiensis)[5]等，天然來源蝦青素較為穩定，使用安全，但存在提取工藝復雜、價格高等問題。

夏側金盞花(AdonisaestivalisL.)，又名福壽花，屬毛茛科(Ranunculaceae)，側金盞花屬(AdonisL.)，其花瓣中含有豐富的類胡蘿卜素，其中蝦青素含量占類胡蘿卜素總量的80%以上，約為花瓣干重的1%，是一種優質的天然蝦青素源[6]。然而，目前有關夏側金盞花的研究主要側重于其中富含的強心甙方面[7]，有關其作為著色劑的研究很少。Kamata等[8]用添加5.05%福壽花花瓣(AF)和0.01%福壽花提取物(AE)(折算成蝦青素含量均為100 mg/kg)的飼料飼喂虹鱒3個月，結果AF組產生了高死亡率(30%)，AE組雖增加了肌肉紅度值，但肌肉中蝦青素沉積量很低，僅為1.17 mg/kg，達不到市場要求(6 mg/kg)。

雨生紅球藻，屬綠藻門(Chlorophyta)，團藻目(Volvocales)，紅球藻屬(Haematococcus)，是目前所有已知天然蝦青素積累量最高的生物，其蝦青素積累量可達干重的5%[9]。雨生紅球藻中的蝦青素通常以酯的形式存在，構型為純左旋結構(3S，3’S)，是抗氧化活性最強的一種構型[10]。然而，雨生紅球藻具有較厚的細胞壁，會阻礙魚類對類胡蘿卜素的吸收利用[11]，降低了藻粉直接作為餌料的利用率。因此，雨生紅球藻作為蝦青素源添加到飼料中，應選用適當的破壁方法，若破壁方法不當，破壁不完全，會影響蝦青素的活性和利用率。雨生紅球藻藻粉在水產養殖中應用的報道已見于虹鱒[12]、大西洋鮭(Salmosalar)[13]、赤鯛(Pagruspagrus)[14]、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)[15]、歐鯰(Silurusglanis)[16]等，這些研究表明雨生紅球藻具有良好的著色和抗氧化作用，并能改善生長性能，提高魚體免疫力。目前在雨生紅球藻上的研究多基于藻粉，而雨生紅球藻提取物(HE)的研究相對較少[2,17]，尤其是在鮭鱒魚類著色方面。

作為天然蝦青素源，AF、AE、HE在改善虹鱒肉色和機體抗氧化性能方面的作用效果如何？與Ast相比，其效果如何？尚未有明確報道。因此,本試驗以虹鱒為研究對象,在飼料中分別添加Ast、AF及AE和HE，考察其對虹鱒生長性能、色素沉積和抗氧化能力的影響，為天然蝦青素源在水產飼料中的合理應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Ast、AF、AE和HE(正丁烷浸提法)均由廣州某生物科技股份有限公司提供，蝦青素含量分別為10.30%、1.54%、2.90%和2.26%。

1.2 試驗飼料

試驗配制5種等氮等能的飼料，分別為基礎飼料和在基礎飼料中分別添加1.0 g/kg Ast、6.5 g/kg AF、3.4 g/kg AE、4.4 g/kg HE的試驗飼料，折算成蝦青素添加量均為100 mg/kg。各種飼料原料粉碎后過60目篩，按飼料配方(表1)逐級混勻，用單螺桿擠壓機制粒成直徑為2.0 mm的硬顆粒沉性飼料[制粒溫度為(85±5)℃]，用鼓風干燥箱40 ℃烘干至水分含量低于10%，密封保存備用。經檢測，這5種飼料中蝦青素含量分別為11.00、95.23、101.32、104.25和93.52 mg/kg。

表1 試驗飼料組成及營養水平(風干基礎)

1.3 試驗魚與飼養管理

試驗用虹鱒購自四川省眉山市東坡區天貴水產養殖場。試驗開始前，將虹鱒暫養2周以適應試驗環境。正式試驗前停止投喂24 h，選取體質健壯、大小均勻的虹鱒375尾[平均體重為(6.28±0.07)g]，隨機分配到15個自動充氣循環玻璃缸內(0.60 m×0.60 m×0.50 m)，每缸25尾魚，共5組，每組3個重復。養殖試驗開始前，取20尾虹鱒于-20 ℃保存，用于初始全魚常規成分分析。養殖期間，每天投喂2次(09：00、16：00)，日投喂量為體重的2%～3%，根據魚的攝食情況和天氣情況進行適當調整，各組投喂水平基本保持一致，以每次投喂無殘餌為宜。養殖期間水溫為13～18 ℃，溶氧含量為6～7 mg/L，pH為7.24～7.78，氨氮含量≤0.2 mg/L，亞硝酸鹽含量≤0.1 mg/L。每天在上午攝食1～2 h后采用虹吸法吸走缸底糞便，每周換水2次，換水量為缸體水量的1/3。養殖試驗在上海海洋大學魚類營養實驗室進行，共持續6周。

1.4 樣品采集

樣品采集參照Zhao等[18]方法，在養殖第2、4和6周末，魚體饑餓24 h后，每缸隨機取3尾魚，用100 mg/L MS-222麻醉。于尾靜脈處采血，8 000 r/min離心10 min，取血清-80 ℃保存，用于測定血清類胡蘿卜素含量。取血后，剝離兩側背部皮膚，取側線與背鰭之間的肌肉，測定色差值后，與皮膚和尾鰭于-20 ℃保存，用于測定組織蝦青素含量。6周養殖試驗結束后，魚體饑餓24 h，對所有缸中虹鱒進行稱重，記錄重量及尾數，從中取3尾魚麻醉后于-20 ℃保存，用于測定全魚常規成分和蝦青素含量。另取6尾魚，3尾采用上述方法采集肌肉、肝臟和血清用于抗氧化能力的測定；另外3尾魚，采集背部兩側肌肉各1.5 g，分別用于滴水損失和冷凍損失的測定。

1.5 測定指標

1.5.1 生長性能

根據虹鱒初重、末重、尾數和投喂量，計算成活率、增重率和飼料系數，計算公式如下：

增重率(%)=100×[末重(g)-初重(g)]/初重(g)；成活率(%)=100×試驗末魚尾數(尾)/試驗初魚尾數(尾)；飼料系數=總攝食量(g)/[末重(g)-初重(g)]。

1.5.2 飼料和全魚組成

末全魚、初始全魚和飼料粉碎后，參照AOAC(2000)進行常規成分分析，方法如下：水分含量采用105 ℃烘干法測定；粗蛋白質含量采用自動凱氏定氮儀(2300-Auto-Analyzer,Fosstecator,瑞典)測定；粗脂肪含量采用氯仿甲醇浸提法測定；粗灰分含量采用550 ℃馬弗爐(SXL-1008馬弗爐，上海精宏實驗設備有限公司)灼燒法測定。

1.5.3 肌肉色差值

虹鱒抽血剝皮后，取側線與背鰭之間的肌肉，用吸水紙將表面水分吸干，再將WSC-S色差計(WSC-S colorimeter，o/d光源,帶光澤,穩定性ΔY≤0.6,上海精密科學儀器有限公司物理光學儀器廠)探頭緊貼于肌肉朝向背脊的一面測量，記錄亮度、紅度和黃度值。

1.5.4 蝦青素含量

肌肉和全魚蝦青素含量參考Zhang等[19]方法，采用氯仿-乙醇(1∶1)萃取法測定；皮膚和鰭條蝦青素含量參考Song等[20]方法，采用二氯甲烷-甲醇溶液(1∶3)萃取法測定。測得吸光度(OD)值后根據蝦青素標準曲線計算蝦青素含量(蝦青素標準品購于上海吉至生化科技有限公司，產品編號A18781)。蝦青素沉積率計算公式如下：

蝦青素沉積率(%)=100×[末全魚蝦青素含量(mg/kg)×末重(kg)-初始全魚蝦青素含量(mg/kg)×初重(kg)]/[投飼量(kg)×飼料蝦青素含量(mg/kg)]。

1.5.5 血清總類胡蘿卜素含量

取0.2 mL血清加入0.4 mL 95%乙醇斡旋混合后，加入1 mL正己烷斡旋混合，1 000 r/min離心5 min，取上清液在470 nm下測定OD值，根據全反式蝦青素標準曲線計算總類胡蘿卜素含量。全反式蝦青素標準曲線的繪制參考Tolasa等[13]。

血清類胡蘿卜素含量(μg/mL)=OD值×10 000/消旋系數E。

1.5.6 肌肉持水力

取虹鱒一側背部肌肉(1.5 g)，稱重(W1)后用細鐵絲懸掛于4 ℃冰箱中，分別于2、4、6 h取出，用吸水紙輕輕拭去表面水分后稱重，記錄重量(W2)。取另一側背部肌肉(1.5 g)，稱重(W3)后裝袋密封，置于-20 ℃冰箱，24 h后取出，室溫解凍10 min，用吸水紙輕輕拭去表面水分后稱重，記錄重量(W4)。滴水損失和冷凍損失計算公式如下：

滴水損失(%)=100×[(W1-W2)/W1]；冷凍損失(%)=100×[(W3-W4)/W3]。

1.5.7 血清、肌肉和肝臟的抗氧化能力

肝臟和背部肌肉于4 ℃解凍后，用0.9%生理鹽水制成20%的組織勻漿液，2 500 r/min離心10 min，取上清備用。血清、肌肉和肝臟的抗氧化性能指標包括：肌肉和肝臟總蛋白(TP)含量，血清、肌肉和肝臟的丙二醛含量(MDA)含量、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性以及抑制羥自由基能力。以上指標的測定均按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書操作，其中蛋白質總量采用考馬斯亮藍法測定，MDA含量采用硫代巴比妥酸(TAB)法測定，抑制羥自由基能力根據Fenton反應測定。

血清和組織T-SOD活性單位定義(U/mL)：每毫升反應液中和每毫克組織蛋白質在1 mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為1個SOD活性單位(U)。

1.6 數據統計與分析

試驗數據采用SPSS 22.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，結合Tukey’s法進行多重比較，差異顯著水平為P<0.05。

2 結 果

2.1 不同來源蝦青素對虹鱒生長性能的影響

由表2可知，養殖6周后，Con、Ast、AE和HE組在增重率、飼料系數和成活率上均無顯著差異(P>0.05)；AF組在增重率上顯著低于其他組(P<0.05)，飼料系數顯著高于其他組(P<0.05)，與對照組相比，AF組增重率降低13.5%，飼料系數增加0.10(P<0.05)。

表2 不同來源蝦青素對虹鱒生長性能的影響

2.2 不同來源蝦青素對虹鱒全魚常規成分的影響

由表3可知，各組間虹鱒全魚常規成分組成，包括水分、粗蛋白質、粗灰分和粗脂肪含量，均無顯著差異(P>0.05)。

表3 不同來源蝦青素對虹鱒全魚常規成分的影響

2.3 不同來源蝦青素對虹鱒肌肉色差的影響

由圖1可知，隨著養殖時間的延長，各組虹鱒肌肉亮度值減小，肌肉紅度值增大；Ast、AF、AE和HE組的肌肉亮度值在各時間點上均顯著低于對照組(P<0.05)，紅度和黃度值顯著高于對照組(P<0.05)；在第6周時，各蝦青素添加組間的肌肉亮度、紅度值無顯著差異(P>0.05)，AE和HE組的肌肉黃度值顯著高于Ast和AF組(P<0.05)。

數據點標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 不同來源蝦青素對虹鱒各組織蝦青素含量和沉積率的影響

由表4可知，各蝦青素添加組的不同組織中蝦青素含量均隨養殖時間的增加而升高。在第2、4、6周時，Ast、AF、AE和HE組的肌肉、皮膚和尾鰭蝦青素含量均顯著高于對照組(P<0.05)；第6周時，HE組的肌肉蝦青素含量最高，AF組的皮膚和尾鰭蝦青素含量最高；在全魚蝦青素含量和蝦青素沉積率方面，Ast、AF、AE和HE組均無顯著差異(P>0.05)，全魚蝦青素含量均顯著高于對照組(P<0.05)，蝦青素沉積率均顯著低于對照組(P<0.05)。

表4 不同來源蝦青素對虹鱒各組織蝦青素含量和沉積率的影響

2.5 不同來源蝦青素對虹鱒血清類胡蘿卜素含量的影響

由表5可知，各組血清類胡蘿卜素含量隨養殖時間的增加而增加，Ast、AF(除第2周外)、AE和HE組血清類胡蘿卜素含量在第2、4、6周時均顯著高于對照組(P<0.05)，且在第4、6周時相互之間無顯著差異(P>0.05)。

表5 不同來源蝦青素對虹鱒血清類胡蘿卜素含量的影響

2.6 不同來源蝦青素對虹鱒肌肉、肝臟和血清抗氧化能力的影響

由表6可知，各蝦青素添加組肌肉和血清的T-SOD活性和MDA含量均顯著低于對照組(P<0.05)，Ast、AF、AE和HE組各組織的抑制羥自由基能力均顯著高于對照組(P<0.05)；AF組的肌肉抗氧化指標與AE組無顯著差異(P>0.05)，但肝臟抑制羥自由基能力顯著低于AE組(P<0.05)，血清T-SOD活性顯著高于AE組(P<0.05)；AE和HE組的肌肉、肝臟和血清抗氧化指標與Ast組均無顯著差異(P>0.05)。

表6 不同來源蝦青素對虹鱒肌肉、肝臟和血清抗氧化能力的影響

2.7 不同來源蝦青素對虹鱒肌肉持水力的影響

由表7可知，各組的滴水損失隨時間的延長而增加，Ast、AE和HE組的滴水損失(除Ast組2 h的滴水損失外)和冷凍損失均顯著低于對照組(P<0.05)；此外，AF組4、6 h的滴水損失也顯著低于對照組(P<0.05)，冷凍損失與對照組無顯著差異(P>0.05)。

表7 不同來源蝦青素對虹鱒肌肉持水力的影響

3 討 論

3.1 不同來源蝦青素對虹鱒生長性能的影響

關于Ast和HP對魚類生長的影響均存在不同報道。Christiansen等[21]和王磊等[22]分別在大西洋鮭魚種(1.75 g)和七彩神仙魚飼料中添加Ast和HP，兩者的生長性能均得到了顯著提高。然而，Page等[23]、Yanar等[24]和Amar等[25]分別在飼料中添加50、70和100 mg/kg Ast，對虹鱒的生長性能均無顯著影響。Pham等[2]在飼料中添加2.0 g/kg HE(折算成蝦青素含量為100 mg/kg)，對牙鲆幼魚增重率、特定生長率和存活率也無顯著影響。本試驗中，Ast和HE的添加，對虹鱒的生長性能也無顯著影響，盡管兩者的飼料系數略高于對照組，但無顯著差異，可能是由試驗誤差引起。蝦青素對魚類生長性能的作用效果，可能與魚的種類、性別、生長階段、飼料組成、養殖條件等因素有關。

本試驗中，AF的添加雖然對虹鱒存活率沒有產生影響(為100%)，卻降低了魚體生長性能，這在一定程度上反映了花瓣中所含的生物堿、強心甙等有毒有害物質對攝食和飼料利用產生了負面影響，表明AF不宜直接添加到虹鱒飼料中。為減輕或消除AF中有毒有害物的影響，對其中的蝦青素進行提取是一條有效的途徑。強心甙是水溶性物質，而蝦青素的提取是一個有機溶劑萃取的過程，故AE中已基本不含強心甙物質。有研究表明，飼料中添加0.01%的AE(折算成蝦青素添加量為100 mg/kg)對虹鱒生長性能無顯著影響[8]，本試驗在飼料中添加3.4 g/kg AE，對虹鱒的生長性能也沒有產生不利影響。今后，福壽花資源的開發利用應走活性物質提取這條道路。

3.2 不同來源蝦青素對虹鱒肉色和蝦青素沉積的影響

虹鱒的肌肉紅度值是其品質的一個重要評價標準，主要取決于體內蝦青素的沉積。Rahman等[26]以添加100 mg/kg Ast的飼料飼喂體重18.5 g的虹鱒10周，顯著增加了肌肉紅度值，肌肉蝦青素含量達到6.1 mg/kg。Zhang等[19]用添加了100 mg/kg的Ast飼料飼喂101 g的虹鱒60 d，肌肉紅度值顯著增加，蝦青素含量達到8.03 mg/kg；De La Mora等[27]在飼料中添加80 mg/kg Ast，飼喂體重161 g的虹鱒6周后，肌肉蝦青素含量可達8.8 mg/kg。本試驗虹鱒養殖6周后，HE和AE組的肌肉紅度值、蝦青素含量均顯著增加，達到和Ast一致的水平，但肌肉蝦青素含量偏低，僅為4.96～5.26 mg/kg，可能與養殖時間較短(6周)以及試驗魚的規格較小有關(初重為6.28 g)。在養殖生產中，通常是在上市前一段時間對虹鱒肌肉進行著色，本試驗采用的虹鱒規格較小，主要是考慮到小規格魚種在實驗室條件下易于開展養殖，可在更大范圍內進行蝦青素源的篩選，從而為虹鱒成魚著色試驗的開展奠定基礎。

此外，本試驗在飼料中分別添加Ast、AF和AE均顯著提高了虹鱒的肌肉紅度和黃度值；其中Ast和AE組在養殖6周末，肌肉紅度值和蝦青素含量均無顯著差異，這與Kamata等[28]在虹鱒上的研究結果一致。然而，Kamata等[8]發現在飼料中添加5.05% AF(折算成蝦青素添加量為100 mg/kg)對虹鱒的肉色無顯著影響，其原因可能是試驗飼料在制作5～6 d后出現了輕微變味，對虹鱒的攝食量產生了較大影響，從而導致色素沉積效果較差。

AF和HP中的蝦青素多數以酯的形式存在[29]，而人工Ast為游離態[9]。有研究表明，酯化蝦青素更有利于動物體吸收，這可能與蝦青素酯極性小，在消化道中的溶解性好有關[30-31]；而Henmi等[32]認為，在同等蝦青素添加量下，游離蝦青素的著色效果優于酯化蝦青素，這可能是因為游離蝦青素與肌動球蛋白結合緊密，單酯化的蝦青素與肌動球蛋白結合弱，而二酯則完全不結合[32]，由此導致酯化蝦青素的沉積效果差。然而，在本試驗中，AF、AE和HE組的蝦青素沉積與Ast組無顯著差異，與Bowen等[33]用添加單酯、雙酯和Ast的飼料飼喂虹鱒的研究結果一致。Schiedt[34]和周慶新等[35]研究認為，蝦青素酯進入動物體后需要進行水解才能被吸收利用。蘇芳[36]的研究也發現，雨生紅球藻源蝦青素在虹鱒體內傳遞的過程中發生了脫酯化。這些研究均表明，蝦青素的酯化并不影響虹鱒對其的吸收利用。

3.3 不同來源蝦青素對虹鱒抗氧化能力的影響

Rahman等[26]和Zhang等[19]分別在飼料中添加50和100 mg/kg蝦青素投喂虹鱒，顯著降低了血清SOD活性；虹鱒攝食添加紅法夫酵母[37]和Ast[18-19]的飼料后，肌肉MDA含量顯著降低。此外，在馬脂鯉(HyphessobryconequesSteindachner)、艷脂鯉(Hyphessobryconcallistus)和斑節對蝦(Penaeusmonodon)飼料中添加Ast也顯著提高了機體抗氧化能力[38-40]。同時，飼料中添加蝦青素還能增強虹鱒血清、肌肉和肝臟抑制羥自由基的能力[18,26]。本試驗在飼料中分別添加AE和HE，虹鱒肌肉、肝臟和血清中的抑制羥自由基能力顯著提高，T-SOD活性和MDA含量顯著降低，達到與Ast一致水平。蝦青素的抗氧化性能與其兩端的紫羅蘭酮環上的不飽和酮基和羥基有關，這些結構均具有較活潑的電子效應，可以吸引自由基或者向自由基提供電子，最終達到清除自由基，提高抗氧化的目的[41]。

系水力是指當肌肉受到加壓、冷凍等外力作用時仍保持原有水分的能力，是反映肌肉品質的一個重要指標，當肌肉暴露于空氣中，會受到一定程度的氧化，致使肌肉表面水分揮發，使得滴水損失增加；當肌肉中存在如蝦青素、維生素E等抗氧化物質時，可以減輕細胞膜的氧化程度，增強肌肉系水力[19,42]。在本試驗中，Ast、AE和HE組的滴水損失和冷凍損失較對照組均有顯著降低(Ast組2 h滴水損失除外)。可見，在飼料中添加Ast、AE和HE均能延長虹鱒肌肉的貨架壽命。本試驗還發現，AE組在6 h的肌肉滴水損失低于Ast和HE組，這意味著AE改善肌肉貨架壽命的能力可能強于Ast和HE，這是否與AE中的其他抗氧化物質有關，有待于進一步研究。

4 結 論

飼料中添加AE、HE能有效改善虹鱒肌肉顏色，增強機體抗氧化能力，達到和添加Ast一致的效果，但AF不宜直接用作虹鱒的著色劑。