妊娠母羊飼糧添加葉酸對不同出生類型新生羔羊臍帶血管生成相關基因表達的影響

彭思嘉 李鶴瓊 羅海玲 王 波 李 貞 王月君

(中國農業大學動物科技學院，動物營養學國家重點實驗室，北京 100193)

胎兒生長發育的營養完全來自于母體，妊娠期母體營養不足會嚴重影響胎兒生長，多胎品種因胎兒數量的增加更易出現這一情況。湖羊作為我國特有的綿羊品種，具有早熟、多胎、早期生長快等特點。有研究表明，在湖羊妊娠后期持續供應全價營養有利于胎兒的指數級生長[1]；綿羊在妊娠后期限飼，營養水平越低，胎兒受限越嚴重[2]。因此，保證妊娠期母體營養充足可以減少母體和胎兒出現不利情況，合理利用母畜生產優質后代，提高生產效率。

葉酸參與核酸和蛋白質的合成，在細胞分裂過程中起重要作用，也是胎盤發育、血管生成的必需條件[3]。葉酸可以通過減少胚胎死亡而提高動物的繁殖能力，對豬和綿羊等多胎動物的胚胎存活和胎兒發育至關重要[4-6]，不足時可能引發心血管疾病[4,7]。綿羊血清葉酸含量在妊娠期間呈先下降后上升的趨勢，并且這一現象在高產品種中更為明顯[6]。隨著飼養集約化程度的提高，飼糧的變化會影響動物的生長，因此推測高產母羊在妊娠期間對葉酸的需求量可能會增加，無法完全通過飼糧和瘤胃微生物合成來滿足。

胎盤作為妊娠期母體和胎兒之間運輸營養物質、氣體和代謝產物的器官，其血管發育與胎盤本身的生長以及胎盤功能正常發揮都密切相關，這對胎兒正常生長和初生重至關重要[3,8-11]。胎盤血管功能不全是胎兒生長受限最常見的病因之一[12]，甚至引發胎兒或母體出現如宮內生長受限、妊娠高血壓、子癇前期、流產、早產或死胎等現象[8]。

本團隊前期研究發現，妊娠母羊飼糧添加過瘤胃葉酸可以顯著增加新生羔羊的初生重，提高促進肌肉發育相關基因的表達，降低抑制肌肉發育相關基因的表達，并提高免疫力[13-14]；還能優化新生羔羊小腸發育相關基因的表達，使新生羔羊小腸發育獲得先天優勢[15]，并且三羔較雙羔對母體葉酸添加更敏感。因為胎兒獲得的營養全部由胎盤通過血管運輸，推測葉酸可能通過影響胎盤發育和臍帶血管生成相關基因[血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)[12,16-17]、轉換生長因子-β3(transforming growth factor-beta 3，TGF-β3)[18-22]、血管生成素-1(angiopoietin-1，ANGPT-1)[8,23-24]]以及臍帶血管內皮生長因子受體基因[血管內皮生長因子受體-1(fms related tyrosine kinase-1，FLT-1)、血管內皮生長因子受體-2(kinase-inserted domain containing receptor，KDR)[25-27]]等參與調控血管生成的關鍵基因的表達，從而導致營養物質的運輸和供給差異，最終影響不同出生類型新生羔羊的初生重。因此，本試驗旨在研究妊娠母羊飼糧添加葉酸對不同出生類型新生羔羊臍帶血管生成相關基因VEGFA、TGF-β3、ANGPT-1、FLT-1和KDR表達的影響，為妊娠母羊飼糧添加葉酸影響不同出生類型新生羔羊臍帶血管生成提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計及飼糧

試驗于2017年5—12月在江蘇省乾寶牧業有限公司進行，提前對羊舍消毒。選用體重相近、年齡一致的經產湖羊母羊120只，人工授精后隨機分為3組，分別飼喂添加0(C)、16(F16)和32 mg/kg DM(F32)葉酸的全混合日糧(TMR)。母羊分娩時記錄窩產仔數，從試驗中淘汰單胎和四胎出生的羔羊，選擇體重相近的新生羔羊根據出生類型和妊娠母羊葉酸添加水平分為6個組。試驗設計見表1。

表1 試驗設計

試驗使用的葉酸為包被葉酸，經前期綿羊瘤胃瘺管半體內試驗測得瘤胃通過率約為92.60%，小腸釋放率約為85.59%。試驗羊單欄飼養，每天07:00和17:00飼喂飼糧，自由飲水。試驗飼糧參照NRC(2007)配制，母羊妊娠前期和后期的TMR組成及營養水平如表2、表3所示。

表3 母羊妊娠后期TMR組成及營養水平(干物質基礎)

1.2 樣品采集

母羊分娩后，收集胎盤，測量并記錄胎盤重量、子葉數；用生理鹽水去除胎盤血漬，剝離胎盤子葉，經生理鹽水清洗后，保存胎盤樣品于液氮中，收集新生羔羊胎兒端臍帶樣品保存于液氮中，從6個組中每組隨機選取3個樣品，共18個臍帶樣品進行后續測定。

1.3 試驗方法

1.3.1 總RNA提取及cDNA合成

選用北京艾德萊生物科技有限公司的EASYspin纖維類組織RNA快速提取試劑盒(RN44)提取臍帶總RNA，使用微量核酸蛋白檢測儀NanoDrop2000分光光度計(Thermo Fisher，美國)測定RNA的濃度和純度并用瓊脂糖凝膠電泳檢驗其質量。對提取的總RNA選用諾唯贊生物的HiScript III 1st Strand Cdna Synthesis Kit試劑盒(R312-01)，建立20 μL、500 ng體系反轉錄合成第1鏈cDNA，于-20 ℃保存。

1.3.2 血管生成相關基因的引物設計及實時熒光定量PCR檢測

參考文獻[18,28-29]及NCBI設計目標基因引物序列，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參，委托北京擎科生物科技有限公司進行引物合成，目標基因引物序列信息如表4所示。

表4 引物序列信息

使用LineGene 964 BIOER熒光定量PCR檢測系統(杭州博日科技有限公司)進行實時熒光定量PCR，選用天根生化科技(北京)有限公司的SuperReal熒光定量預混試劑(SYBR Green，FP205)，建立20 μL反應體系，包括：10 μL 2×SuperReal PreMix Plus，正向、反向引物各0.6 μL，1 μL cDNA模板，RNase free ddH2O補齊至20 μL。采用兩步法進行擴增，PCR反應程序為：95 ℃預變性15 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，共40個循環，收集熒光信號。

試驗中每個模板每個基因做3個技術重復，結果取平均值，采用相對定量法分析數據，采用2-△△Ct法[30-31]計算目的基因在樣本中的相對表達水平，其中：

△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因；△△Ct=(Ct目的基因-Ct內參基因)-(Ct目的基因平均值-Ct內參基因平均值)。

1.4 統計分析

應用Excel 2016整理相關數據，導入SPSS 21.0軟件，用GLM進行主效應(出生類型和葉酸添加水平)分析，并用Duncan氏法進行多重比較檢驗，結果以平均值表示。使用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖。P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 妊娠母羊飼糧添加葉酸對不同出生類型新生羔羊胎盤發育的影響

如表5所示，妊娠母羊飼糧添加葉酸對胎盤重、子葉數、胎盤效率均無顯著影響(P>0.05)。

表5 妊娠母羊飼糧添加葉酸對不同出生類型新生羔羊胎盤發育的影響

2.2 妊娠母羊飼糧添加葉酸對不同出生類型新生羔羊臍帶血管生成相關基因表達的影響

如表6所示，妊娠母羊飼糧添加葉酸對不同出生類型新生羔羊臍帶VEGFA基因的相對表達水平有顯著影響(P<0.05)，但對TGF-β3、ANGPT-1基因的相對表達水平無顯著影響(P>0.05)。0 mg/kg DM葉酸添加水平組的新生羔羊臍帶VEGFA基因的相對表達水平顯著低于16、32 mg/kg DM葉酸添加水平組(P<0.05)。三羔組的新生羔羊臍帶ANGPT-1基因的相對表達水平顯著高于雙羔組(P<0.05)。各基因的相對表達水平分析中，妊娠母羊飼糧葉酸添加水平和出生類型交互作用不顯著(P>0.05)。

表6 妊娠母羊飼糧添加葉酸對不同出生類型新生羔羊臍帶血管生成相關基因表達的影響

2.3 妊娠母羊飼糧添加葉酸對不同出生類型新生羔羊臍帶血管內皮生長因子受體基因表達的影響

如表7所示，妊娠母羊飼糧添加葉酸對不同出生類型新生羔羊臍帶FLT-1、KDR基因的相對表達水平無顯著影響(P>0.05)。各基因的相對表達水平分析中，妊娠母羊飼糧葉酸添加水平和出生類型交互作用不顯著(P>0.05)。

表7 妊娠母羊飼糧添加葉酸對不同出生類型新生羔羊臍帶血管內皮生長因子受體基因表達的影響

3 討 論

3.1 妊娠母羊飼糧添加葉酸對胎盤發育的影響

胎盤重指在分娩結束后排出的胎盤重量，子葉數指胎盤上的子葉個數[32]，胎盤效率這一概念由Wilson等[33]首次在豬上提出，即初生窩重與胎盤重的比值，被認為是子宮容量的指標。對豬[34]、薩福克羊[35]的相關研究發現，窩產仔數與胎盤效率密切相關，且產仔數越多胎盤效率越高。但也有研究表明，隨著產仔數的增加，綿羊的胎盤效率顯著降低[36]。前期研究發現，妊娠母羊飼糧添加葉酸可以顯著增加新生羔羊初生重[13-14]，但在本試驗中，妊娠母羊飼糧葉酸添加水平和出生類型對胎盤重、子葉數、胎盤效率均無顯著影響，這可能是由于物種或品種差異造成的研究結果不統一，還需要進一步研究。雖然各組胎盤重均值不同，但胎盤的發育程度是有限的，而湖羊相比薩福克羊體型較小，體重較輕，胎盤的生長發育可能不會隨著胎兒數增多而持續增長。

3.2 妊娠母羊飼糧添加葉酸對不同出生類型新生羔羊臍帶血管生成相關基因表達的影響

血管內皮生長因子促進血管內皮細胞的分裂和遷移，主要調控血管生成，妊娠期間由胎盤組織產生并參與血管生成[16]。其中VEGFA作為血管形成和功能的主要調節因子，在血管生成和內皮細胞生長中起作用，能誘導血管通透性等，在胚胎發育過程不可或缺[12]。比如在兔后肢缺血模型中，添加VEGFA能通過促進血管生成刺激血流灌注[37]；向糖尿病大鼠胚胎添加葉酸，檢測到VEGFA基因的相對表達水平增加，促進血管生成以及血管形態正常化[17]；而在宮內生長遲緩豬胎盤中，VEGF基因的相對表達水平顯著降低[38]。這說明組織中VEGFA基因的相對表達水平增加可以促進血管生成，發生在胎盤中時可能影響營養運輸。本試驗中，妊娠母羊飼糧添加葉酸顯著提高了VEGFA基因的相對表達水平，說明妊娠母羊補充葉酸可以可能促進了臍帶血管生成，影響母體和胎兒間的營養物質運輸。

TGF-β3同樣具有調節血管系統的作用，可調節細胞生長過程和血管生成，是重要的內源性微血管生成調節因子[19]。在人和小鼠上的研究表明，TGF-β缺失時可能因為血管缺陷而具有胚胎致死性[20]。向體外培養牛和大鼠血管內皮細胞中添加TGF-β3時，可以促進血管內皮細胞的增殖、遷移和血管生成[21]；在大鼠的脂肪干細胞和卵巢的自體移植中，檢測到TGF-β3基因的相對表達水平上升，血管密度增加[18,22]。但本試驗中，妊娠母羊飼糧添加葉酸和出生類型對TGF-β3基因的相對表達水平均無顯著影響，可能由于體內試驗與細胞試驗的內環境存在較大差異造成的。

ANGPT-1可以與血管內皮生長因子協同作用并增強其作用，誘導系統發育健全和穩定進行血管生成[23]。ANGPT-1對脈管系統成熟和重塑非常重要，缺乏時會引發功能不全[24]，胚胎缺乏ANGPT-1表現出心血管缺陷并在妊娠中期死亡[8]。ANGPT-1和血管生成素-2(angiopoietin-2，ANGPT-2)都是在胎盤中表達的血管生成生長因子，它們競爭相同受體——內膜內皮細胞特異性酪氨酸激酶受體-2(Tie-2)；前者是Tie-2受體的主要激動劑，后者則有可能是Tie-2的拮抗劑或部分激動劑[24]。本試驗中，妊娠母羊飼糧添加葉酸對ANGPT-1基因的相對表達水平無顯著影響，推測ANGPT-1會與ANGPT-2競爭Tie-2受體[23]，引起三者表達的變化，還需結合ANGPT-2和Tie-2基因的相對表達水平作進一步研究分析；但三羔組臍帶ANGPT-1基因的相對表達水平顯著高于雙羔組，可能有利于多羔臍帶血管生成，說明不同出生類型可能影響胎盤臍帶向胎兒運輸更多營養物質。

3.3 妊娠母羊飼糧添加葉酸對不同出生類型新生羔羊臍帶血管內皮生長因子受體基因表達的影響

血管發育過程中，血管內皮生長因子主要通過與FLT-1和KDR結合發揮生理作用[37]。FLT-1主要在胚胎發育過程中作為VEGFA功能的負調控因子，降低VEGFA對KDR的可用性，防止信號過度轉導[12]，可溶性FLT-1可以與血管內皮生長因子結合并抑制其活性[9]。而KDR作為血管內皮生長因子的主要受體，主要介導內皮細胞增殖，從而提高血管通透性[25-26]，僅激活KDR就足以激活參與有絲分裂和細胞遷移的信號轉導因子，也可以通過封閉KDR抑制血管內皮生長因子活性，影響內皮細胞增殖[27]。本試驗中，妊娠母羊飼糧添加葉酸和出生類型對FLT-1、KDR基因的相對表達水平均無顯著影響，與前人關于小鼠病理性血管模型中FLT-1、KDR基因的相對表達水平上調的研究結果[25]不一致，可能是因為葉酸添加水平或者物種差異引起的。但無論是雙羔還是三羔，16、32 mg/kg DM葉酸添加水平組FLT-1基因的相對表達水平與0 mg/kg DM葉酸添加水平組相比有下降的趨勢，與VEGFA基因表達的變化趨勢相反，因為FLT-1負調控血管內皮生長因子功能，推測隨著FLT-1基因的相對表達水平下降，VEGFA能更大程度上發揮其促進血管生成的生理功能。

4 結 論

妊娠母羊飼糧添加葉酸對胎盤發育沒有顯著影響，但是顯著提高了新生羔羊臍帶VEGFA基因的相對表達水平，有利于新生羔羊臍帶血管生成。同時，新生羔羊三羔臍帶ANGPT-1基因的相對表達水平顯著高于雙羔，有利于多羔臍帶血管生成。