諾麗果原粉對絨山羊體外瘤胃發酵功能的影響

張清月 梁曉帥 李胤豪 馬國強 郭曉宇 趙艷麗 閆素梅

(內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古自治區動物營養與飼料科學重點實驗室，呼和浩特 010018)

內蒙古絨山羊作為世界著名的絨肉兼用型品種，其肉質細嫩、膻味小且營養價值高。但由于天然草場的營養物質季節性不平衡以及我國禁牧力度的不斷加強，絨山羊的養殖逐漸由放牧轉變為舍飼和半舍飼養殖。然而，集約化養殖易使絨山羊產生氧化應激，甚至引起營養代謝病，進而降低其生產性能。抗生素在解決上述問題時也帶來了食品安全隱患，且飼料中的全面禁抗使得養殖產業中替抗產品的開發尤為需要。諾麗(MorindacitrifoliaL.，藥名海巴戟)在我國東南部地區種植廣泛，其果實含有豐富的營養物質和生物學活性物質，主要為多酚類、糖苷類和生物堿等，具有抗菌、消炎和提高免疫力等多種功效[1]，極具開發為綠色飼料添加劑及新型替抗產品的前景。目前，國內外對于諾麗果的研究主要集中在其功能性成分的提取和分析上，以及以小鼠[2]、雞[3]和犢牛[4]為模型研究其藥理作用，或是研究其工業廢棄物對奶山羊體外發酵的影響[5]。然而，將諾麗果作為飼料添加劑應用于絨山羊等反芻動物養殖領域的研究目前還未見報道。瘤胃作為反芻動物最重要的消化器官，其功能對于營養物質和能量的獲取具有重要意義。但活體試驗動物數量大、試驗周期長且成本高，研究工作常受到限制。而體外瘤胃發酵可在離體環境下模擬瘤胃內的消化過程，且更為省時省力。因此，本試驗利用體外瘤胃發酵結合多項組合效應值(MFAEI)，研究飼糧中添加不同劑量的諾麗果原粉對絨山羊瘤胃發酵功能的調控作用，以期為諾麗果資源在飼料領域的綜合利用提供基礎，也為絨山羊養殖中替抗產品的開發提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

諾麗果風干片由海南省五指山市諾麗果基地提供，于65 ℃烘干，粉碎后過40目篩制成諾麗果原粉。

3.系統內普法與社會普法不平衡。各級各部門在落實責任制過程中，存在系統內普法與社會普法不能并重的情況。許多單位積極開展社會普法，緊密結合本部門法律法規頒布實施紀念日、宣傳日、紀念周等重要普法節點，組織開展各類有聲有色的普法活動，但卻忽視對系統內執法人員和工作人員的普法，執法工作人員法律素養不夠高，法治意識不夠強，開展“誰執法誰普法”的廣度與深度不夠，實效性欠缺。

1.2 試驗動物和基礎飼糧

選取3只體況相近、年齡為2.5歲的健康絨山羊羯羊(品系為內蒙古阿爾巴斯白絨山羊)作為瘤胃液供體羊。每天于09:00和15:00對供體羊進行飼喂，供體羊自由飲水，基礎飼糧參照我國《肉羊飼養標準》(NY/T 816—2004)配制，基礎飼糧組成及營養水平見表1。

于剛性輪，其中在空載工況中尤為明顯，脫軌系數減小43.84%，超限時間減少26.09%。直線軌道上彈性輪和剛性輪的脫軌系數均未超過限值，彈性輪的最大值略小。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.3 試驗設計

參考Menke等[7]的方法配制緩沖液，稱取1 g發酵底物放入高壓滅菌的發酵瓶中，于39 ℃預熱。于晨飼前經口腔采集3只絨山羊的瘤胃液，混合后經1層紗布過濾至已預熱達39 ℃并通有二氧化碳(CO2)的保溫瓶中。將瘤胃液與緩沖液按1∶2的比例混合，并分裝至上述玻璃瓶中，培養體系為60 mL，該步驟全程通CO2進行。將發酵瓶密封后于39 ℃氣浴搖床培養，轉速為120 r/min。培養時間分別為3、6、9、12和24 h，到達各時間點后，迅速將相應的培養瓶取出，冰浴終止發酵，并取樣測定各項指標。

表2 NF1～NF4組試驗飼糧的營養水平(風干基礎)

1.4 體外培養方法

試驗采用完全隨機區組設計，設5個諾麗果原粉添加劑量，試驗飼糧分別以0(對照組，CON組)、1.0%(NF1組)、2.0%(NF2組)、3.5%(NF3組)和5.0%(NF4組)的諾麗果原粉等比例替代基礎飼糧中的玉米；并設5個培養時間點，分別為3、6、9、12和24 h；每個培養時間點設6個重復(即每個添加劑量有30個發酵瓶)。其中，CON組的發酵底物為基礎飼糧，營養水平與瘤胃液供體羊基礎飼糧的營養水平相同；NF1～NF4組試驗飼糧的營養水平見表2。

1.5 測定指標與方法

粗蛋白質(CP)含量的測定參照《飼料中粗蛋白的測定 凱氏定氮法》(GB/T 6432—2018)；粗脂肪(EE)含量的測定參照《飼料中粗脂肪的測定》(GB/T 6433—2006)；鈣含量的測定參照《飼料中鈣的測定》(GB/T 6436—2018)，采用高錳酸鉀法；磷含量的測定參照《飼料中總磷的測定 分光光度法》(GB/T 6437—2018)；中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量的測定參考Van Soest等[8]的方法，采用ANKOM纖維分析儀；pH用CT-6022型手持便攜式pH計測定；氨態氮(NH3-N)濃度的測定采用比色法[9]；菌體蛋白(BCP)濃度的測定采用考馬斯亮蘭法[10]；原蟲數量的測定參考馮仰廉[11]的方法；揮發性脂肪酸(VFA)濃度的測定采用氣相色譜法[12]，以二乙基丁酸為內標，并計算總揮發性脂肪酸(TVFA)濃度；產氣量采用ANKOM RFS體外產氣系統進行測定；參考盧德勛[13]的計算方法，對單項組合效應值(SFAEI)及MFAEI進行計算，MFAEI是不同組合(處理)的各指標SFAEI之和，SFAEI的計算公式如下式：

用染色序列對P進行著色,實際上是對m(2n+1)+2n-1條邊進行著色,而圖4中色集合的個數有個,根據上述染色算法,當k是奇數時,有當k是偶數時,有因此恒成立,此時求得最小的整數k滿足?。

1.6 統計分析

由表3可知，添加不同劑量的諾麗果原粉均顯著降低了體外瘤胃發酵pH、NH3-N濃度和原蟲數量(P<0.05)；NF3組NH3-N濃度最低，顯著低于其他各組(P<0.05)；NF3組原蟲數量也最低，顯著低于NF1組(P<0.05)。隨諾麗果原粉添加劑量的增加，NH3-N濃度和原蟲數量均呈顯著的一次線性和二次曲線下降(P<0.05)，而pH也呈顯著的一次線性和二次曲線下降(P<0.05)。添加不同劑量的諾麗果原粉顯著提高了BCP濃度(P<0.05)；其中，NF3和NF4組BCP濃度顯著高于NF1組(P<0.05)；NF3組BCP濃度最高，顯著高于NF2組(P<0.05)。NF3和NF4組產氣量顯著高于CON組(P<0.05)，且以NF3組最高。隨諾麗果原粉添加劑量的增加，BCP濃度和產氣量均呈顯著的一次線性升高(P<0.05)。發酵時間對pH、NH3-N濃度、BCP濃度、原蟲數量和產氣量均有顯著影響(P<0.05)。隨著培養時間的延長，pH呈下降趨勢；產氣量呈上升趨勢；NH3-N濃度、BCP濃度和原蟲數量則呈先升高再下降的趨勢，并在培養12 h達最高值。添加劑量與培養時間的交互作用對原蟲數量有顯著影響(P<0.05)，培養3和6 h時各組原蟲數量較少，培養12 h時CON組的原蟲數量最多。

式中：m為各培養時間點(m=1，2，3，4，5)；n為培養時間點的個數(n=5)；A1m為組合前(對照組)各單一指標不同培養時間點的數值；A2m為組合后(試驗組)各單一指標不同培養時間點的數值。

由表4可知，NF2和NF3組乙酸濃度顯著高于CON組(P<0.05)，且以NF3組最高，顯著高于NF1和NF4組(P<0.05)；NF1～NF4組丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和TVFA濃度顯著高于CON組(P<0.05)，乙酸/丙酸顯著低于CON組(P<0.05)。NF3組丁酸、戊酸和TVFA濃度最高，其中，NF3組丁酸和TVFA濃度顯著高于其他組(P<0.05)，而戊酸濃度顯著高于NF1組(P<0.05)；NF2～NF4組異戊酸濃度顯著高于CON組(P<0.05)。隨著諾麗果原粉劑量的增加，乙酸和異丁酸濃度呈顯著的二次曲線升高(P<0.05)，乙酸/丙酸呈顯著的二次曲線下降(P<0.05)；戊酸和異戊酸濃度呈顯著的一次線性升高(P<0.05)，而丙酸、丁酸和TVFA濃度呈顯著的一次線性和二次曲線升高(P<0.05)。發酵時間對乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、TVFA濃度和乙酸/丙酸有顯著影響(P<0.05)。隨培養時間的延長，除乙酸/丙酸呈先下降、再趨于平緩、之后再下降的趨勢；其他指標均呈上升趨勢。添加劑量與培養時間的交互作用對TVFA濃度有顯著影響(P<0.05)，培養24 h時NF3組的TVFA濃度最高，培養3 h時各組的TVFA濃度較低。

2 結 果

2.1 諾麗果原粉對體外瘤胃發酵pH、NH3-N濃度、BCP濃度、原蟲數量和產氣量的影響

使用SAS 8.1對數據進行統計分析，采用MIXED模型進行方差分析和回歸分析，混合模型包括諾麗果原粉的添加劑量、培養時間、添加劑量×培養時間的交互作用以及發酵瓶的隨機效應。P<0.05表示差異顯著。

表3 諾麗果原粉對體外瘤胃發酵pH、NH3-N濃度、BCP濃度、原蟲數量和產氣量的影響

2.2 諾麗果原粉對瘤胃體外發酵VFA濃度的影響

3.死亡體重。據筆者的資料分析，仔豬初生重0.5 kg以下，哺乳期間死亡占死亡總數的80%以上，0.6～1.0 kg占13%，1.1 kg以上占6%?？梢姡胸i初生重越小，死亡率越高。

表4 諾麗果原粉對瘤胃體外發酵VFA濃度的影響

2.3 諾麗果原粉對瘤胃體外發酵MFAEI的影響

由表5可知，添加諾麗果原粉后，BCP濃度、TVFA濃度和產氣量的SFAEI均顯著升高(P<0.05)；且NF3和NF4組BCP濃度的SFAEI顯著高于NF1和NF2組(P<0.05)；而TVFA濃度和產氣量的SFAEI均以NF3組最高，且NF3組TVFA濃度的SFAEI顯著高于其他各組(P<0.05)，而產氣量的SFAEI顯著高于NF1和NF2組(P<0.05)。BCP濃度、TVFA濃度和產氣量的SFAEI均隨諾麗果原粉添加劑量的增加呈顯著的線性和二次曲線升高(P<0.05)。并且，NF1～NF4組的MFAEI顯著升高；以NF3組最高，顯著高于其他各組(P<0.05)；以NF4組次高，顯著高于NF1和NF2組(P<0.05)。MFAEI隨諾麗果原粉添加劑量的增加呈顯著的一次線性和二次曲線升高(P<0.05)。

表5 諾麗果原粉對瘤胃體外發酵MFAEI的影響

3 討 論

瘤胃液中的BCP濃度是綜合評價蛋白質利用效率及微生物種群數量的重要指標，而NH3-N是合成BCP的主要氮源。因而在一定范圍內NH3-N濃度的降低和BCP濃度的升高暗示著瘤胃內蛋白質合成效率的提高。所以，原蟲的存在增加了氮在瘤胃內的周轉和消耗，去原蟲更有利于提高反芻動物的氮利用效率[14]。合成優質BCP也需要適宜的pH維持瘤胃發酵穩態，pH在6.0～7.0之間利于BCP的合成[15]。在本試驗中，添加諾麗果原粉后pH雖下降，但仍在BCP合成的適宜范圍內；而NH3-N濃度和原蟲數量的下降以及BCP濃度的增加，則表明添加諾麗果原粉可以促進體外瘤胃發酵的氮降解并提高機體對氮的利用效率。關于本試驗中諾麗果原粉的降原蟲數量功能，有研究表明每100 g成熟諾麗果中的皂苷含量約為236.0 mg[16]，且皂苷類物質可通過破壞原蟲細胞膜殺死原蟲[17]，因而諾麗果原粉的降原蟲作用可能與其含有皂苷類物質有關。

產氣量是間接評定飼料樣品營養價值及其在瘤胃內發酵狀況的指標[18]；而VFA是反芻動物的主要能量來源，也是瘤胃微生物重要的碳架來源，其濃度與組成是反映瘤胃消化及其代謝能力的重要指標[19]。本試驗中，產氣量和VFA濃度顯著升高，說明添加諾麗果原粉可顯著促進飼料樣品體外瘤胃發酵及其營養物質代謝；而乙酸/丙酸顯著下降，則說明諾麗果原粉可優化VFA組成，提高能量利用效率，為BCP合成提供充足碳源。分析本試驗中pH降低的原因，可能與諾麗果原粉中有機酸含量較高[20]或培養液中VFA濃度增加有關；也可能是因為培養液中原蟲數量的減少，致使原蟲因儲存淀粉而穩定pH的作用減弱[21]，進而導致體外發酵pH的下降。諾麗果促進瘤胃發酵的機理尚不清楚，這可能與諾麗果中含有多糖、酚類等活性物質有關[22]。目前尚未見這方面的研究報道，但關于其他多糖的體內外研究表明，黃芪多糖[23]、苦瓜多糖[24]、香菇多糖或木聚糖[25]等均可促進瘤胃發酵。因而，可能是諾麗果多糖調控了瘤胃微生物多樣性及其代謝產物，進而影響了瘤胃發酵，需要進一步研究探討。

MFAEI可反映飼料間的整體互作，其數值越大，對應的飼料組合越有利于瘤胃發酵以及營養組分的利用。因此，可利用MFAEI判斷飼料的適宜配比。本試驗的各指標回歸分析結果表明，隨諾麗果原粉添加劑量的增加，pH、BCP濃度、產氣量和異戊酸濃度呈顯著的一次線性變化趨勢，其他指標呈顯著的二次曲線劑量依賴效應，且極值均出現在NF3組。雖然MFAEI的一次線性和二次曲線升高趨勢均顯著，但以NF3組最高，NF4組次高，且二者差異顯著。這說明諾麗果原粉的添加劑量為3.5%時，促進瘤胃發酵的效果較好，而當添加劑量增至5.0%時，促進瘤胃發酵的效果減弱。MFAEI對諾麗果添加劑量的二次曲線響應是可以預見的，因為高劑量的諾麗果所具有的抗菌性更強，因而可能會使其促瘤胃發酵作用減弱。類似的，無籽諾麗果渣在體外發酵中促TVFA生成的作用與其添加劑量呈顯著的二次曲線升高趨勢，最佳添加劑量為10%～15%，而添加20%～25%時TVFA濃度與對照組無顯著差異[5]。飼糧中添加沙棘果渣可促進體外瘤胃發酵，但添加24%時的TVFA濃度顯著低于添加16%時[26]。目前，關于諾麗果促進瘤胃發酵的機理尚不清楚，今后需進一步從其多糖、酚類物質等方面，研究諾麗果促瘤胃發酵的功效物質，并結合微生物多樣性等多組學聯合分析技術深入探究諾麗果促瘤胃發酵的機理。

4 結 論

飼糧中添加諾麗果原粉可促進阿爾巴斯白絨山羊的體外瘤胃發酵功能，并降低原蟲數量，且均在添加劑量為3.5%時效果較好。