亞急性瘤胃酸中毒對反芻動物瘤胃生理功能及物質吸收轉運的影響

姜雅慧 代 鵬 張雅嵐 王之盛*

(1.四川農業大學動物科技學院，成都 611130；2.四川農業大學動物營養研究所，成都 611130)

為提高反芻動物的生產性能以及獲得最大的經濟產出，反芻動物飼喂大量以谷物淀粉為主要能量飼料的高精料飼糧。反芻動物大量采食富含快速發酵的碳水化合物飼糧后會引起瘤胃揮發性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)蓄積，瘤胃液pH降低，瘤胃菌群紊亂，引發亞急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis，SARA)。瘤胃酸中毒的發生不僅會影響反芻動物的采食量和動物副產品如肉、奶的產出量，而且會打破瘤胃微生物區系間的平衡而使反芻動物對飼料的消化和營養物質代謝減弱，并伴隨有腹瀉、消化道損傷和炎癥、肝臟膿腫、蹄病以及乳脂下降綜合征等病征[1]。Stefańska等[2]對波蘭9個牛場213頭奶牛檢測發現約14%奶牛患有SARA。我國在育肥牛、羊和奶牛養殖中SARA發病率在19%～26%，嚴重制約了我國反芻動物養殖業的發展[3]。瘤胃上皮不僅是反芻動物營養物質消化吸收的重要部位，還是瘤胃微生物附著、生長以及瘤胃微生物代謝的主要部位，瘤胃上皮的結構完整性以及功能的保護對于反芻動物健康養殖至關重要。本綜述從生產中常見的營養代謝疾病SARA入手，圍繞反芻動物瘤胃上皮結構、功能以及上皮細胞中參與物質轉運相關載體等進行綜述，以期對反芻動物SARA的調控提供理論基礎和技術支持。

1 SARA狀態下瘤胃發酵模式及瘤胃菌群的變化

1.1 瘤胃發酵模式變化

Gozho等[4]定義反芻動物瘤胃液pH下降至5.6以下并持續3 h以上則處于SARA狀態。在相同飼糧和同一飼養管理方式下，不同牛只對SARA的敏感性不同[5]，反芻動物減少咀嚼和反芻時間導致唾液分泌量降低，進而增大牛只患SARA的風險。Nagata等[6]通過飼糧誘導荷斯坦公牛SARA后發現，飼喂高谷物飼糧會導致瘤胃液pH急劇下降，瘤胃內VFA和氨態氮濃度升高，乙酸比例降低，而丁酸比例升高。SARA會改變瘤胃發酵模式和VFA的產量，降低乙酸/丙酸，瘤胃中乙酸/丙酸由3.07下降到1.74，瘤胃中脂多糖(LPS)含量升高[2,7]。SARA耐受性高的山羊瘤胃對丁酸、酮體和質子的轉運速率更快，進而改變血液代謝通量[8]，SARA還會改變瘤胃中硫胺素濃度，瘤胃中硫胺素濃度與瘤胃液pH和乙酸濃度呈正相關，而與瘤胃中乳酸濃度呈負相關[9]。

1.2 瘤胃菌群的變化

Mao等[10]對患SARA奶牛微生物區系分析發現，SARA會降低瘤胃微生物的多樣性，從門水平上看，SARA會降低變形菌門和擬桿菌門豐度，而厚壁菌門和放線菌門豐度有所增加；從屬水平分析，奶牛患SARA后，瘤胃中普雷沃菌屬、厭氧支原體屬、密螺旋菌屬、不動桿菌屬、乳酸桿菌屬和一些未分類的細菌豐度降低，而瘤胃中球菌屬、奇異菌屬、雙歧桿菌豐度升高。SARA會改變瘤胃中普雷沃菌屬和乳酸桿菌屬數量，也會改變瘤胃固相微生物區系結構[11]。高谷物組牛瘤胃內普雷沃菌屬、真桿菌屬和顫螺旋菌屬豐度低于高粗料組，而瘤胃球菌屬豐度則相反[6]。隨瘤胃內pH降低，瘤胃內真桿菌屬和未分類梭菌科(unclassified Clostridiaceae)的豐度逐漸降低，但隨著SARA的反復發生會引起瘤胃部分微生物如真桿菌屬和unclassified Clostridiaceae的豐度逐漸增加，但具體機制尚需進一步研究[6]。反芻動物處于SARA狀態下會抑制瘤胃中纖維的降解并伴隨著瘤胃內參與纖維降解的白色瘤胃球菌和產琥珀酸絲狀桿菌的豐度降低，而普雷沃菌屬、乳酸菌屬、埃氏巨球型菌屬的豐度增加。SARA還會嚴重抑制瘤胃內甲烷的產生，但對瘤胃內產甲烷菌無影響[12]。Plaizier等[13-14]通過誘導奶牛發生SARA后比較其瘤胃內微生物區系變化發現，SARA會改變瘤胃內微生物的豐度、多樣性和穩定性，飼糧中增加谷物含量會降低瘤胃中擬桿菌的豐度，SARA會增加瘤胃內埃氏巨型球菌屬和厚壁菌門數量，瘤胃微生物90個分類單元中有9個分類單元也受SARA的影響。通過對比圍產期前后SARA對荷斯坦奶牛影響研究中發現，SARA并不是引起瘤胃內微生物區系的直接原因，而可能通過對微生物區系在瘤胃中參與的功能途徑改變來影響微生物區系的豐度和多樣性[15]。SARA會改變瘤胃微生物區系豐度和多樣性，但是否直接影響瘤胃微生物的生長以及與外界環境和動物生理狀態的相互影響還有待探究。

2 SARA對瘤胃上皮細胞形態結構和功能的影響

2.1 瘤胃上皮細胞生長和形態結構變化

瘤胃上皮由黏膜向漿膜面分為角質化細胞層、顆粒層細胞、棘狀細胞層和基底層。反芻動物瘤胃內VFA的積累會誘發SARA的發生，SARA會導致瘤胃上皮細胞損傷[16]。早期，Nocek等[17]研究表明精粗比太高會使瘤胃乳頭形態異常。近年研究也表明，SARA可使瘤胃壁黏膜出現不同程度的脫落，使瘤胃上皮基底層、顆粒層、棘突層和瘤胃上皮變薄，上皮細胞間緊密連接結構變得松弛[16,18-20]。SARA會使瘤胃上皮角質層變厚，棘狀層細胞線粒體出現降解并出現空泡，各層細胞如角質層、顆粒層、棘狀層和基底層細胞甚至出現損傷和壞死，細胞間連接破壞，細胞間隙增大，棘突層出現氣泡，線粒體降解，細胞界限模糊，上皮細胞通透性增加[20-23]。鄔宇航[24]通過分子水平檢測發現SARA會使瘤胃上皮細胞微絨毛排列不整齊，線粒體腫脹，染色質邊集化，并出現較多的凋亡小體，抑制瘤胃上皮細胞增殖。短鏈脂肪酸會上調瘤胃上皮細胞中細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A，引起細胞周期蛋白依賴性激酶和周期蛋白的表達降低，使瘤胃上皮細胞從G1期到S期受阻，抑制瘤胃上皮細胞生長，但短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFA)對瘤胃上皮細胞增殖影響的詳細機制還需進一步探究[25]。

2.2 瘤胃上皮屏障功能

瘤胃的黏膜屏障由瘤胃上皮細胞及其連接所組成的機械屏障、化學屏障、生物屏障及免疫屏障組成[26]。瘤胃上皮屏障能有效抵擋瘤胃中產生的有害物質如組胺、內毒素等進入機體組織，同時又可允許營養物質、水等進入機體。瘤胃上皮通透性是反映瘤胃上皮屏障功能最直接的標志，屏障功能受損則瘤胃上皮通透性升高。飼糧在瘤胃內快速發酵引起瘤胃內VFA積累，長期低pH的酸性環境刺激會改變瘤胃上皮細胞的組織結構形態，瘤胃上皮緊密連接蛋白降解或其在瘤胃上皮細胞上的表達分布改變，細胞連接破壞，上皮細胞各部分受損，影響瘤胃的屏障功能，導致有害物質如LPS、內毒素等通過細胞進入血液，引起動物機體炎癥反應或誘發系列疾病[27-28]。Penner等[29]研究表明，在低pH時會使瘤胃上皮組織結構改變，血液滲透壓升高，上皮細胞屏障功能受損；另外，短暫瘤胃酸中毒可能不影響上皮細胞屏障功能，但長期低pH刺激下，瘤胃上皮通透性增加，使其屏障功能減弱。劉軍花[21]還進一步驗證了SARA影響瘤胃屏障的具體機制，發現SARA可以激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細胞外信號調節蛋白激酶1/2(ERK1/2)信號通路，低pH和LPS含量會提高ERK1/2磷酸化比例，引起瘤胃上皮細胞緊密連接蛋白表達下降，進而影響瘤胃上皮屏障功能。利用尤斯室法研究SARA對細胞屏障功能的影響發現，SARA會增強瘤胃上皮細胞組織的導電性能，降低單位時間通過上皮組織的電荷流量，進而影響瘤胃細胞屏障功能[29]。SARA會引起瘤胃上皮細胞的短路電流、組織導電性升高，而跨膜電位差則降低[18,20]。但在，Aschenbach等[30]和Penner等[29]分別以體外調節環境酸度和灌注葡萄糖誘導SARA發現，組織導電性增加，但短路電流降低。綜上可知，SARA會以破壞上皮細胞組織結構和導電性使瘤胃上皮細胞屏障功能受損，改變瘤胃上皮對LPS、內毒素等的屏障隔離作用。

3 SARA對瘤胃上皮細胞物質轉運及相關載體表達的影響

4 SARA引起瘤胃內代謝異常反應

劉軍花[21]對山羊誘導SARA發現，SARA會激活瘤胃上皮免疫反應，引發瘤胃上皮細胞炎癥反應。張瑞陽[38]通過代謝組學研究發現，高精料誘發奶牛SARA會導致瘤胃中LPS、乙醇胺、生物胺和戊二酸等異常代謝物或促炎物含量增加，通過基因芯片技術研究分析，促炎癥相關因子白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-22(IL-22)、趨化因子CCL19、趨化因子CCL8、趨化因子CX3C受體1(CX3CR1)和CXC趨化因子配體6(CXCL6)等的表達量顯著上調，抗炎癥因子如白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-15受體拮抗劑(IL-15RA)的表達量顯著下調，表明SARA觸發了瘤胃上皮局部炎癥反應，并且瘤胃上皮炎癥因子與瘤胃環境因子(pH和LPS)存在相關性，LPS會使瘤胃上皮細胞中IL-1β、IL-2、IL-6和白細胞介素-8(IL-8)的表達量顯著上調，而低pH會提高瘤胃上皮細胞腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)的表達量。Zhang等[39]通過對比飼喂高精料和低精料飼糧奶牛瘤胃上皮細胞中炎癥相關基因表達，也發現促炎癥相關因子表達上調，而且LPS促使瘤胃上皮細胞中IL-1β、IL-2、IL-6和IL-8的表達量升高，同時低pH處理會使TNF-α的表達升高。Stefanska等[40]通過分析來自13個牧場的305頭泌乳奶牛瘤胃液pH、瘤胃內發酵產物和瘤胃內毒素含量以及相關基因表達，發現白細胞中LPS受體功能相關基因[如白細胞分化抗原14(CD14)、Toll樣受體4(TLR4)、髓樣分化蛋白2(MD2)]的mRNA相對豐度出現差異，而且酸中毒組與健康組奶牛相比，血液中的高密度脂蛋白、血清淀粉樣蛋白A、鈣和結合珠蛋白含量均出現顯著差異，以及LPS結合蛋白含量也有顯著差異。同時，瘤胃pH與LPS受體功能相關基因表達量以及血漿高密度脂蛋白含量有負相關性，而與血漿鈣含量有正相關性，表明降低瘤胃液pH會增加瘤胃中LPS的釋放并激發LPS相關受體的表達和相應的免疫反應，進而導致血漿高密度脂蛋白含量升高，血漿Ca含量降低。

發生SARA的牛只瘤胃上皮細胞中核轉錄因子-κB p65(NF-κB p65)、核因子轉錄-κB抑制蛋白α(IκB-α)和氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)以及EKB1/2的磷酸化水平顯著高于正常生理狀態牛只，發生SARA的牛只瘤胃上皮細胞中核轉錄因子-κB(NF-κB)、MAPK調控的炎癥因子、TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA和蛋白表達量均高于正常牛只，同樣發生SARA的牛只血漿中TNF-α和IL-6含量也顯著升高[41]。SARA發生可以產生溶血磷脂酸(LPA)和組胺等異常代謝產物，這些產物能作為信號分子激活NF-κB和MAPK信號通路，通路中的關鍵蛋白如IκBα、NF-κB p65、JNK和ERK1/2磷酸化水平增高，進一步誘導促炎癥因子靶基因轉錄，增加了促炎癥因子表達，引發瘤胃上皮及其他相關組織炎癥反應。

5 小結與展望

反芻動物發生SARA，會改變瘤胃發酵模式，降低乙酸/丙酸，瘤胃內LPS含量增加，瘤胃內微生物區系的穩定性和多樣性也會發生改變。對于瘤胃上皮細胞而言，會破壞其結構的完整性，主要表現為細胞間連接破壞、各層細胞厚度發生改變以及細胞通透性增加，導致瘤胃上皮屏障功能受損。瘤胃上皮細胞對營養物質吸收、轉運和代謝發生改變。同時患SARA會誘發瘤胃上皮細胞的局部炎癥反應，激活瘤胃上皮細胞免疫反應，引起上皮細胞中炎癥相關基因表達變化。瘤胃上皮細胞中營養物質的吸收、轉運和代謝過程以及引發的炎癥反應受多種調控因子的影響，這些因子還參與瘤胃上皮細胞的增殖調控，調控因子可以通過不同信號通路影響瘤胃結構和功能。反芻動物發生SARA后，瘤胃上皮細胞調控因子受哪些信號通路調控以及具體的調控機制還需深入研究，以明確SARA對反芻動物生產性能影響的具體機制，便于飼養管理者在生產實踐中進行理論指導，最大程度減少和避免SARA發生對動物生產帶來的損失。