采用不同提取方法、利用超高效液相色譜-串聯質譜檢測雞肉中喹諾酮類藥物殘留的影響

王 磊 劉延平 王魯霞 朱 輝 陶相錦

菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院 山東菏澤 274000

喹諾酮類藥物是在動物產品中常用的合成抗生素類藥物，但是過量的使用會在動物食品中殘留，并進一步危害人類的身體健康。在畜禽產品的獸藥殘留檢測技術上與發達國家相比存在一定的差距，使得國內市場時常發生畜禽產品質量安全問題，嚴重影響出口貿易。同時，在動物源性食品中濫用抗生素類藥物，還會導致各種耐藥菌株的出現。目前，世界各組織與歐盟等國，對于喹諾酮類藥物在畜禽產品中的殘留量都做了具體規定；食品安全國家標準規定，禽肉中恩諾沙星的最大殘留限量為100μg/kg；在肝臟和腎臟中的限量要高，分別不得高于200、300μg/kg，而氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、諾氟沙星不得檢出。

畜禽產品的基質成分十分復雜，在對樣品進行分析檢測時，會有不同程度的基質干擾現象，所以在進行檢測之前，要盡量消除基質對于實驗結果的干擾。對動物源性食品中獸藥殘留的檢測，學者進行了探究。而喹諾酮類藥物的檢測方法主要有高效液相色譜(HPLC)、超高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)、酶聯免疫吸附技術(ELISA)等[1]。在測定動物源性食品獸藥殘留量的技術中，目前常用的提取方法，如超聲萃取技術[2]、固相萃取法[3]等，都可以有效地提取目標藥物、消除基質干擾。目前，提取溶劑的種類較多，它們的理化性質不盡相同，即使是相同種類的溶劑，其配比不同，分離提取效果也會不同。不僅如此，在檢測分析的過程中，提取過程的不同環節，都會影響藥物殘留檢測分析。對于采用液質聯用法檢測雞肉中喹諾酮類藥物殘留的問題，其解決問題的關鍵，是要建立科學的檢測技術，以便能更好的監測動物產品中藥物的殘留量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

喹諾酮標準混合溶液，美國A Chemtek公司提供，批號：S039627，濃度100μg/mL，用甲醇溶解配制成濃度為1.0μg/mL的標準中間儲備液，臨用時準確量取適量標準儲備液用流動相稀釋成適宜濃度的標準工作液。

化學試劑：乙腈、甲醇、甲酸、色譜純；所有試劑均用超純水配制。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜-質譜聯用儀TQ-S，Waters公司；

電子分析天平ME204，METTLER TOLEDO公司；

高速冷凍離心機3K15，德國SIGMA公司；

數控超聲波清洗器KQ-500DB型，昆山市超聲儀器有限公司；

固相萃取裝置，Waters公司；

氮氣吹干儀OA-HEAT型，Organomation公司；

多管漩渦混合儀HD-2500型，杭州佑寧儀器有限公司；

具塞塑料離心管；

有機相針式濾器(0.22μm)；

HLB固相萃取柱Oasis Prime HLB 6 cc/200 mg，Waters公司；

移液槍200μL、1mL，Eppendorf公司。

1.3 樣品溶液的制備

準確稱取已均質的雞肉制品2.00g于50mL聚丙烯離心管中，加入10mL 0.2%甲酸/乙腈/水溶液(80+20)，搖勻分散后渦旋提取2min，超聲波提取15min，以8 000r/min離心15min，取一定量的上清液用Prime HLB固相萃取柱進行凈化，控制流速不超過1.0mL/min。凈化液于45℃條件下用氮氣蒸發至近干，加入1mL 0.1%甲酸/乙腈/水溶液(10+90)渦旋復溶，過0.22μm微孔濾膜，用HPLC-MS/MS檢測。

1.4 色譜及質譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱參數：Acquity UPLCHSS T3(2.1 mm×100 mm，粒徑1.8 μm)。

流動相：乙腈為A相，0.1%甲酸/水溶液為B相，流動相初始比例為A∶B=10∶90(V/V)，線性梯度洗脫(0～1min，10%A→10%A；1～3.5min，10%A→90%A；3.5～4min，90%A→90%A；4～4.1min，90%A→10%A；4.1～6.5min，10%A→10%A)。

流速：0.3mL/min。

柱溫：40℃。

進樣體積：5μL。

1.4.2 質譜條件

質譜條件：離子源為電噴霧離子源(ESI)。

掃描方式：正離子掃描。

監測方式：多反應監測(MRM)。

毛細管電壓：3 000V。

離子源溫度：350℃。

2 結果與分析

2.1 不同提取液的影響

甲醇、乙腈、乙腈/水、乙腈/水/0.2%甲酸作為萃取劑時，相應的實驗結果如表1所示。

測定喹諾酮類藥物在雞肉樣品中加標量為5ng/g水平上的回收量。結果顯示，使用乙腈和乙腈/水(80+20)溶液作為萃取劑時，萃取率相對較低；使用甲醇作為提取劑時，回收率比使用乙腈和乙腈/水(80+20)高，但環丙沙星未檢出。

表1 不同提取液的影響

表1中結果顯示，當在體積分數為80%的乙腈/水溶液中加入0.2%甲酸作為提取溶劑時，7種喹諾酮類藥物的提取效率較高，因為80%的乙腈能使樣品中的蛋白質緩慢的進行變性，離解與其結合的藥物，而用純乙腈提取液時，由于乙腈濃度過大，使得蛋白質快速變性，從而迅速凝聚包裹住目標喹諾酮藥物，提取液不能充分接觸藥物，導致提取率較低[4]。當用甲醇作為提取液時，由于甲醇不能使樣品中的蛋白質充分變性，使得藥物與蛋白質的結合態不能被充分破壞，從而使喹諾酮藥物的提取率較低。采用80%的乙腈/水/0.2%甲酸溶液提取體系，能完全破壞蛋白質與喹諾酮類藥物之間的強結合作用，使藥物充分的釋放到提取溶劑中，得到較高的提取效率，加入0.2%甲酸的目的是為了在進行質譜檢測過程中提高其檢測信號值。同時，80%的乙腈/水/0.2%甲酸溶液具有較強的極性，強極性使得提取液中脂溶性雜質減少，有利于質譜的檢測。所以本實驗選用80%的乙腈/水/0.2%甲酸溶液作為提取雞肉中喹諾酮類藥物的最佳溶劑。

2.2 超聲時間的影響

為了進一步闡明雞肉中超聲提取時間對提取喹諾酮類藥物的影響，選擇不同的提取時間來提取藥物，本實驗考察了不同的超聲提取時間(5～30min)對恩諾沙星、氧氟沙星、沙拉沙星，這3種典型喹諾酮類藥物提取效果的影響。從圖1中可以看出，不同提取時間對沙星的提取影響較為顯著。超聲波提取能使樣品完成均一化。這可能是由于超聲提取法雖然能將喹諾酮類藥物從細胞中提取出來，但過低的提取時間很難對樣品萃取做到完全均質統一。樣品經過超聲處理，提取率有所提高，而超聲15～20min時，超聲波對喹諾酮類藥物的破壞性較大，明顯比超聲提取10min時低，提取效果不佳。當超聲30min時，通過超聲可以使細胞破裂，從而溶出更多喹諾酮類藥物，提取效果較優，但提取時間較長，且操作局限性大，不符合快速檢測的要求。因此，超聲提取10min效果最佳。

圖1 超聲時間的影響Fig. 1 The influence of ultrasonic time

2.3 凈化柱Prime HLB柱的影響

本實驗比較了不同的上柱體積對樣品中7種喹諾酮類藥物的凈化、提取效果。提取溶劑在提取雞肉樣品中喹諾酮類藥物的同時，也會將雞肉樣品中其他成分提取出來，因此需要對樣品的超聲提取液進行凈化處理。為了更好的提純目標化合物，提高色譜柱的性能，本實驗采取Prime HLB柱作為凈化柱。實驗結果如表2所示，測定喹諾酮類藥物在雞肉樣品中加標量為5ng/g水平上的回收量。采取Prime HLB柱，3～5mL直接上樣的回收率較高，主要原因是直接過濾法屬于物理過濾法，除了去除大分子蛋白質和脂肪等雜質外，并不會除去喹諾酮這類小分子的物質，所以回收率較高。因此，本方法可以簡化實驗操作步驟，減少了喹諾酮類藥物在實驗過程中的損失，降低了實驗檢測成本。

表2 不同體積的影響

2.4 不同加標量的影響

取空白雞肉樣品中添加4個濃度水平的混合標準液，按優化所得的前處理方法進行處理，做回收率試驗，每個水平重復3次。本實驗考慮到雞肉中脂肪含量較高，采用柱凈化富集進行預凈化處理。所以，目標化合物在前處理過程中會有損失。

表3 不同加標量的影響

由表3可知，洛美沙星和氧氟沙星的回收率不高，可能是由于基質成分對喹諾酮類藥物的干擾所致。采取Prime HLB柱作為凈化柱除去大量雜質的同時，也將喹諾酮類藥物帶走，導致回收率不高，而加標量為5ng/g水平上的回收率均大于60%，符合食品中喹諾酮類藥物檢驗檢測標準要求。

3 結論

本研究通過利用高效液相色譜串聯質譜具有高效、高靈敏度的特點，優化了同時檢測雞肉中7種喹諾酮類藥物殘留的分析方法。同時，液質聯用法采用的多離子反應監測模式，使喹諾酮類藥物的色譜峰圖有足夠的數據采集點數，提高了靈敏度，降低了檢測限[5]。通過分析不同種類提取溶劑、超聲時間、凈化體積、加標量對提取效果的影響，快速、高效的將多種喹諾酮藥物分離，所提取的藥物能夠進行準確的定量分析。本實驗方法適用于雞肉中喹諾酮類藥物的檢測分析，具有靈敏度高、分析快速等特點，可滿足雞肉中喹諾酮類藥物多殘留檢測的需要。