黃獨(dú)微型塊莖鯊烯合酶的基因克隆與序列分析

柯維忠 鐘雯娟 劉凱盈 李祥媛 尹明華

（上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，上饒 334001）

黃獨(dú)（Dioscorea bulbifera L.）為薯蕷科（Dioscoreaceae）薯蕷屬（Dioscorea）植物，在東南亞、大洋洲、非洲和美洲均有分布［1］。黃獨(dú)地下塊莖俗稱“黃藥子”，藥用歷史悠久，唐代孫思邈的《千金·月令》曾記載“以萬(wàn)州黃藥子浸酒可治瘤疾”［2］。據(jù)《中國(guó)藥典》（1963）記載：黃藥子性味苦、辛涼，有小毒，可散結(jié)消癭、清熱解毒、涼血降火、化痰散結(jié)［3～4］。藥理學(xué)研究表明，黃藥子具抗病毒、抗腫瘤、抗炎、抗菌等功效［5～6］。生長(zhǎng)于黃獨(dú)莖蔓上的珠芽俗稱“零余子”，在組培中特稱為微型塊莖，可用作藥膳直接食用［7］，還可作繁殖材料用于黃獨(dú)的大田生產(chǎn)［8］。

黃藥子含薯蕷皂苷元（diosgenin）等甾類成分［9］，可用于合成口服避孕藥及各種激素類藥物［10～12］。薯蕷皂苷元來(lái)自于萜類合成途徑［13］，角鯊烯（Squalene）是植物萜類化合物生物合成的共同前體［14］。鯊稀合酶（squalene synthase，SQS）可催化2分子的法呢基焦磷酸（FPP）產(chǎn)生1分子的前鯊烯焦磷酸（PSPP）［15］，并可催化PSPP 縮合產(chǎn)生角鯊烯。因此，鯊稀合酶含量和活性決定了薯蕷皂苷元的產(chǎn)量［16］。研究表明，SQS 在薯蕷屬植物中過(guò)量表達(dá)能夠明顯提高薯蕷皂苷元的含量［17］。

近年來(lái)，黃獨(dú)的藥用價(jià)值愈加得到人們重視，黃獨(dú)的市場(chǎng)需求較為旺盛，造成黃獨(dú)資源的缺乏。因此，采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行育苗，是提高黃獨(dú)種苗的有效途徑。采用基因工程手段來(lái)調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶SQS 在甾醇和三萜類化合物代謝途徑中的表達(dá)，從而促進(jìn)藥用活性代謝產(chǎn)物的積累具有重要意義及應(yīng)用價(jià)值［18］。目前，對(duì)黃獨(dú)的莖尖脫毒快繁［19］、種質(zhì)超低溫保存［20］以及微型塊莖誘導(dǎo)形成［21］等方面已經(jīng)開展研究，今后利用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法提高薯蕷皂苷的產(chǎn)量，也是薯蕷皂苷生產(chǎn)的一個(gè)總方向［22］。本文以黃獨(dú)微型塊莖為材料，克隆其皂苷合成代謝途徑中的黃獨(dú)鯊稀合酶（SQS）基因，并對(duì)其進(jìn)行序列分析，為進(jìn)一步研究黃獨(dú)SQS 基因結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)、基因突變提供了基礎(chǔ)，為薯蕷屬植物三萜合成通路關(guān)鍵酶SQS 的正選擇位點(diǎn)與功能的關(guān)聯(lián)性分析提供了數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

黃獨(dú)試管苗微型塊莖由上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院植物組織培養(yǎng)室提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

從黃獨(dú)微型塊莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選的SQS基因中間序列為基礎(chǔ)，利用primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物：RC190-SQS-1F（GGTAGAGACWGTTGATGACTATGATGA）；RC190-SQS-1R（TCTCCTCATATTTCAAATCCTCWAG）；RC190-SQS-1R1（TTCCAATYGCCATGAYCTGA）。接頭引物：3′adaptor（GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTT）；5.3′outer（GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC）；5.3′inner（GCTACGTAACGGCATGACAGTG）；AUAP（GGCCACGCGTCGACTAGTAC）；AAP（GCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG）。3′RACE 特異性引物：RC190-SQS-F1（CTGGGTTGGTTGGATTGGGACTTTCT）；RC190-SQS-F2 （CACGAATGTTTTGGCCTCGTCACAT）；RC190-SQS-F2i（ATCGACATATATGATGTAGA）。5′RACE特異性引物：RC190-SQS-R6（CATATTTACTCCAAATGTGACGAGGCCAA）；RC190-SQSR5（TGGAGTTCTCCTCATATTTCAAGTCCTCAA）；RC190-SQS-RT1（GCCATGTACGTAAGGCAATCCTCAGCA）。

1.2.2 RNA抽提與純化

按照柱式Trizol 總RNA 提取試劑盒（生工試劑盒SK1312）說(shuō)明進(jìn)行。1.5%瓊脂糖，1×TAE 電泳緩沖液，紫外透射光下觀察并拍照。

1.2.3 cDNA第一鏈合成

在0.2 mL PCR 管中加入以下試劑（10μL total RNA；1 μL 3′adaptor）。70°C 溫浴5 min。冰浴2 min，離心加入下列試劑（4.0 μL 5X First-Strand Buffer；2 μL 10 mmol·L-1dNTP；1 μL Rnase inhibitor；2 μL Reverse Transcriptase；20.0 μL Total volume）。42°C溫浴60 min，72°C溫浴10 min。

1.2.4 基因調(diào)取

PCR 反應(yīng)體系：2×GC Buffer Ⅰ12.5 μL；F（10μmol·L-1）0.5 μL RC190-CAS-1F；R（10 μmol·L-1）0.5 μL RC190-CAS-1R/RC190-CAS-1R1；dNTP（2.5 mmol·L-1）4 μL；ddH20 6.3 μL；Template 1 μL（cDNA）；Taq 酶（5 U·μL-1）0.2 μL。總體積25 μL。PCR 循環(huán)條件：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸60 s；72℃修復(fù)延伸7 min。33 個(gè)循環(huán)。按照柱式DNA 膠回收試劑盒（生工試劑盒B518131）進(jìn)行PCR 電泳與回收。1%糖凝膠電泳觀察結(jié)果。PCR產(chǎn)物膠回收測(cè)序。

1.2.5 3′RACE

巢氏PCR 反應(yīng)體系（以3′adaptor 為反轉(zhuǎn)引物的cDNA 為模版）：第一輪【2×GC Buffer Ⅰ12.5μL；F（10 μmol·L-1）RC190-CAS-F3 0.5 μL；R（10μmol·L-1）0.5 μL（5.3′outer）；dNTP（2.5 mmol·L-1）4μL；ddH2O 6.3 μL；Template 1 μL（cDNA）；Taq 酶（5 U·μL-1）0.2 μL；總體積25 μL】；第一輪【2×GC Buffer Ⅰ25 μL；F（10 μmol·L-1）RC190-CAS-F4 1μL；R（10 μmol·L-1）1 μL（5.3′inner）；dNTP（2.5 mmol·L-1）8 μL；ddH2O 12.5 μL；Template 1 μL（第一輪PCR 稀釋產(chǎn)物）；Taq 酶（5 U·μL-1）0.5 μL；總體積50μL】。PCR 循環(huán)條件：第一輪（95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸60 s；72℃修復(fù)延伸7 min。33 個(gè)循環(huán)）；第二輪（95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸60 s；72℃修復(fù)延伸7 min。33 個(gè)循環(huán)）。按照柱式DNA 膠回收試劑盒（生工試劑盒B518131）進(jìn)行PCR 電泳與回收。1%糖凝膠電泳觀察結(jié)果。PCR產(chǎn)物膠回收測(cè)序。

1.2.6 5′RACE

巢氏PCR 反應(yīng)體系（末端加C 法，以特異性引物RC190-CAS-RT1/RC190-SQS-RT1 反轉(zhuǎn)，得到cDNA，經(jīng)RNase H 和TdT 處理后，進(jìn)行巢氏PCR，操作步驟見(jiàn)invitrogen 5'race system manual）：第一輪【2×GC Buffer Ⅰ12.5 μL；F（10 μmol·L-1）0.5 μL（AAP）；R（10 μmol·L-1）0.5 μL（RC190-CAS-R5/RC190-CAS-R9）；dNTP（2.5 mmol·L-1）4 μL；ddH2O 6.3 μL；Template 1 μL（cDNA）；Taq 酶（5 U·μL-1）0.2 μL；總體積25 μL】；第一輪【2×GC Buffer Ⅰ25μL；F（10μmol·L-1）1μL（AUAP）；R（10μmol·L-1）1 μL（RC190-CAS-R6/RC190-CAS-R10）；dNTP（2.5 mmol·L-1）8μL；ddH2O 12.5μL；Template 1μL（第一輪PCR稀釋產(chǎn)物）；Taq酶（5 U·μL-1）0.5μL；總體積50μL】。PCR循環(huán)條件：第一輪（95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s；68℃退火30 s；72℃延伸60 s；72℃修復(fù)延伸7 min。33個(gè)循環(huán)）；第二輪（95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s；68℃退火30 s；72℃延伸60 s；72℃修復(fù)延伸7 min。33個(gè)循環(huán)）。按照柱式DNA膠回收試劑盒（生工試劑盒B518131）進(jìn)行PCR電泳與回收。1%糖凝膠電泳觀察結(jié)果。PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序。

1.2.7 序列拼接

利用DNAMAN 軟件將中間序列及RACE 實(shí)驗(yàn)得到的序列進(jìn)行拼接，得到基因全長(zhǎng)序列。

1.2.8 分析方法

測(cè)序獲得的基因cDNA 序列經(jīng)NCBI 的ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）服務(wù)器，進(jìn)行開放閱讀框分析。此外，借助Prot-Param pI/Mw（http：//web.expasy.org/compute_pi）、GOR IV（http：//npsa-pbil. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat. pl？ page=npsa_gor4. html）、SWISSMODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）軟件預(yù)測(cè)目標(biāo)序列一、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)；再依次利用SigalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）軟件預(yù)測(cè)基因編碼氨基酸的信號(hào)肽和疏水性/親水性；最后使用Blastp 工具在NCBI 上查找基因同源氨基酸序列，并運(yùn)用MEGA4.0 軟件中的近鄰相接法（nerghborjoining，NJ）（1000 BootStrap）構(gòu)建同源進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA 提取

黃獨(dú)微型塊莖總RNA 的電泳圖見(jiàn)圖1。左側(cè)泳道可清晰觀察到28S 和18S 兩條區(qū)帶，表明提取的RNA較為完整，質(zhì)量較高，可用于RT-PCR。

2.2 黃獨(dú)微型塊莖SQS基因克隆

通過(guò)RACE 技術(shù)（見(jiàn)圖2），得到全長(zhǎng)為1 548 bp 的cDNA 序列，經(jīng)NCBI 的ORF finder 進(jìn)行開放閱讀框分析，得到415 bp的氨基酸序列。

2.3 SQS基因預(yù)測(cè)氨基酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

ProtParam pI/Mw 軟件預(yù)測(cè)顯示，SQS 編碼蛋白的理論分子量Mw 為46 786.38 D，等電點(diǎn)（pI）為5.97。

2.4 SQS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

由GOR IV 軟件預(yù)測(cè)得知（見(jiàn)圖3），SQS 蛋白主要是由alpha 螺旋（藍(lán)色部分53.25%），延伸鏈（紅色部分10.84%）以及無(wú)規(guī)則卷曲（黃色部分35.90%）所構(gòu)成，本蛋白質(zhì)可能不包含有beta 折疊結(jié)構(gòu)。

2.5 SQS蛋白親水性/疏水性預(yù)測(cè)

通過(guò)Prot Scale 軟件預(yù)測(cè)分析（見(jiàn)圖4）發(fā)現(xiàn)，在SQS 蛋白質(zhì)氨基酸序列中，大部分殘基為疏水性，其中第109 與110 位具有最低分值，為-2.233，梳水性最強(qiáng)。大部分的親水性氨基酸殘基分值都處于較低的位置，其中第183 位具有最高分值，為3.822，親水性最強(qiáng)。預(yù)測(cè)SQS 蛋白具有較強(qiáng)的疏水性，為疏水性蛋白。

2.6 SQS蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)與分析

SignalP 4.0 Server 軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，SQS 編碼蛋白的第24位苯丙氨酸殘基可能是信號(hào)肽原始剪切微店，其最高預(yù)測(cè)分值及最高的信號(hào)肽分值分別僅為0.125和0.12，第24位丙氨酸殘基的最高綜合剪切微店分值0.122，綜合分析結(jié)果表明SQS蛋白無(wú)信號(hào)肽。

2.7 SQS蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析（見(jiàn)圖5）顯示本蛋白質(zhì)主要由alpha 螺旋，延伸鏈以及無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析表明SQS 蛋白包含有SQS 所必需的功能結(jié)構(gòu)域。

2.8 SQS蛋白功能預(yù)測(cè)

通過(guò)SQS 氨基酸序列比對(duì)KEGG 庫(kù)，得到直系同源KEGG 號(hào)：K00801（http：//www.genome.jp/dbget-bin/www_bget？K00801）。參與酶促反應(yīng)過(guò)程有：2 trans，trans-Farnesyl diphosphate（2，6-反式-法尼基二磷酸）＜=＞Diphosphate（二磷酸）+Presqualene diphosphate（角鯊烯磷二酸酯）；Presqualene diphosphate（角鯊烯磷二酸酯）+NADPH+H+＜=＞Diphosphate（二磷酸）+Squalene（角鯊烯）+NADP+；2 trans，trans-Farnesyl diphosphate（2，6-反式-法尼基二磷酸）+NADPH+H+＜=＞Squalene（角鯊烯）+2 Diphosphate（2二磷酸）+NADP+。

2.9 SQS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

保守區(qū)域預(yù)測(cè)結(jié)果如圖6所示，黃獨(dú)SQS蛋白屬于Isoprenoid_Biosym_C1 superfamily，具有典型的SQS基因結(jié)構(gòu)域。

2.10 SQS蛋白的氨基酸同源性分析

應(yīng)用NCBI 中的BlastP 程序，對(duì)SQS 蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白與Di?oscorea zingiberensis（盾葉薯蕷，AGN32410）的SQS蛋白氨基酸相似性為96.4%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析也顯示，該蛋白與Dioscorea zingiberensis SQS 蛋白（AGN32410）親緣關(guān)系較近。

3 討論

我國(guó)薯蕷屬植物約有60 種，基本生長(zhǎng)于長(zhǎng)江以南，其中約40 種可藥用［23］。薯蕷皂苷元是薯蕷屬植物的主要有效化學(xué)成分，一種從植物膽固醇中提取的甾體化合物，是世界上合成甾體類藥物的典型起始中間體，商業(yè)上主要從薯蕷屬植物的根莖或塊莖中提取，具有抗炎、抗腫瘤、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等生物活性等［24～25］，也是醫(yī)藥工業(yè)合成甾體激素藥和口服避孕藥的重要工業(yè)原料［26］。薯蕷皂甙元是藥用植物的生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的克隆、表達(dá)和調(diào)控是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)［27］。SQS是所有三萜皂苷、甾醇、膽固醇等萜烯類重要物質(zhì)的共同前體［28］，因此對(duì)SQS 的研究具有重要意義。SQS 是一種微粒體酶［29］，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜［30］，是三萜皂苷類化合物生物合成的一個(gè)關(guān)鍵酶［31～33］。鑒于SQS 在類異戊二烯途徑中的關(guān)鍵地位［18］，目前已有很多藥用植物的SQS 基因被克隆和分析，如黑老虎［13］、牛樟芝［14］、建澤瀉［15］、浙貝母［17］、桑黃［18］等。然而有關(guān)薯蕷屬SQS 基因的研究少見(jiàn)報(bào)道。盾葉薯蕷鯊烯合酶包含一個(gè)1 230 bp 的開放閱讀框，編碼409 個(gè)氨基酸的多肽，預(yù)測(cè)分子量為46 kda，等電點(diǎn)為6.2［34］。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)黃獨(dú)微型塊莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，篩選到SQS 基因的中間序列核心片段，利用RACE 技術(shù)獲取該基因全長(zhǎng)cDNA序列，生物信息學(xué)分析表明，SQS 基因編碼序列長(zhǎng)1 548 bp，編碼415 bp 的氨基酸序列，理論分子量Mw為46 786.38 D，等電點(diǎn)（pI）為5.97，與盾葉薯蕷的SQS 蛋白氨基酸相似性為96.4%。這是在黃獨(dú)中首次分離到該基因，研究結(jié)果為下一步利用該基因構(gòu)建表達(dá)載體，分析其在微型塊莖誘導(dǎo)形成過(guò)程中所具有的功能具有重要意義，同時(shí)，也為進(jìn)一步研究黃獨(dú)總皂苷合成代謝機(jī)制和利用次生代謝工程的手段提高黃獨(dú)品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。