響應內生菌侵染的兩個地黃茉莉酸合成關鍵基因的克隆與表達分析

彭淑萍 董誠明，2 朱畇昊，2*

（1. 河南中醫(yī)藥大學藥學院，鄭州 450046；2. 呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450046）

地黃（Rehmannia glutinosa Libosch）為玄參科（Scrophulariaceae）地黃屬（Rehmannia）植物，地黃的塊根作為中藥使用，是四大懷藥之一。地黃不僅具有滋補功效而且還具有清熱養(yǎng)血、養(yǎng)陰生津等作用［1］。地黃的化學成分包括環(huán)烯醚萜及其苷類、苯乙醇及其苷類、萜類及其苷類、揮發(fā)油、黃酮類［2～3］，以環(huán)烯醚萜苷類為主，而在環(huán)烯醚萜苷中以梓醇的含量最高。

植物次生代謝產(chǎn)物是一大類小分子化合物，在植物體中的基礎含量一般都很低。然而在生物壓力脅迫（昆蟲取食、病原菌或內生菌侵染）和非生物的壓力脅迫（機械損傷、植物激素）下，或者在一定的誘導條件下，次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量通常有一定的提高［4～6］。例如，鹽脅迫下西紅柿中茉莉酸等在植物中大量的積累［7］。激素之間進行相互作用，進一步調控植物次生代謝過程。茉莉酸是一種普遍存在于植物中的重要次級代謝產(chǎn)物，而且作為一類植物激素，其對植物的生長發(fā)育、系統(tǒng)防御以及次級代謝產(chǎn)物的合成起著關鍵的調控作用［8～9］。如，外源茉莉酸能減輕受侵染水稻稻瘟病發(fā)病癥狀，并誘導水稻防御相關基因不同程度的上調表達［10］，茉莉酸作為信號分子在內生真菌與茅蒼術拮抗平衡中起到特定作用［11］。

茉莉酸的生物合成途徑主要有從亞麻酸開始的十八烷途徑和從十六碳三烯酸開始的十六烷途徑。其中，丙二烯合酶（allene oxide synthase，AOS）催化13-氫過氧化亞麻酸（13-HPOT）形成12，13-環(huán)氧十八碳三烯酸（12，13-EOT），后者在后續(xù)酶的催化下形成Jas 合成途徑中的關鍵中間產(chǎn)物12-氧代植二烯酸（OPDA）。OPDA 在12-氧代植二烯酸還原酶（12-oxophytodienoate reductase，OPR）還原后，再經(jīng)3次氧化最后形成茉莉酸。因此，AOS和OPR均是植物體內茉莉酸合成途徑的關鍵酶。AOS 屬于P450 超基因家族中的一員，普遍存在于植物組織中［12］。水稻AOS 家族共有4 個成員［13］；陸地棉AOS基因家族有6個成員［14］，地黃轉錄組數(shù)據(jù)庫中有2 條Unigene 被注釋為AOS 基因；OPR 隸屬于古老黃酶（Old yellow enzyme，OYE）家族，是一種黃素單核苷酸（Flavin mononucleotide，F(xiàn)MN）依賴的氧化還原酶［15］。在許多高等植物中相繼發(fā)現(xiàn)了OPR 基因，番茄OPR 基因家族有3 個成員［16］，豌豆OPR 基因家族有6 個成員［17］，玉米OPR 基因家族有8 個成員［18］以及水稻OPR 基因家族有13 個成員［19］，地黃轉錄組數(shù)據(jù)庫中有6 條Unigene 被注釋為OPR 基因。目前，在許多種植物中克隆了AOS和OPR 基因并進行了相關功能的研究，如：金銀花［20］、長春花［21］、茛菪［22］、青蒿［23］、白木香［12］等植物的AOS 基因已經(jīng)被克隆，甘蔗［24］、葡萄［25］、金魚草［26］等植物的OPR 基因也已經(jīng)被克隆，于地黃AOS 和OPR 基因的克隆及其功能分析的研究尚未見報道。本課題組前期通過比較內生真菌GG22侵染前后地黃無菌苗轉錄組的差異，分別注釋到一條能被GG22 誘導的AOS 和OPR 基因。本研究通過逆轉錄PCR技術，利用被內生真菌GG22侵染29 d的地黃無菌苗cDNA 為模板，克隆獲得了地黃AOS（GenBank登錄號MN846745）和OPR（GenBank登錄號MN846746）基因，并對其進行了生物信息學分析、組織特異性表達及其在GG22侵染不同時間的表達特性分析，為深入驗證兩基因的相關功能和在地黃內生真菌侵染過程中扮演的角色奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

地黃（R.glutinosa Libosch）種植于河南中醫(yī)藥大學植物園，于開花時挖取地黃植株整株，洗凈后分別取根、葉、花組織，提取總RNA，檢測AOS 和OPR基因在不同器官中的特異性表達。

地黃無菌苗培養(yǎng)于河南省道地藥材生態(tài)種植工程技術研究中心實驗室。將地黃無菌苗接種在1/2MS的固體培養(yǎng)基，地黃苗在該培養(yǎng)基中生長大約至5 cm 時，再次將其接種于蛭石培養(yǎng)基中，3～4 d 后，將已經(jīng)活化的內生真菌GG22 涂布與載玻片上，面積為1 cm×1 cm，載玻片距離地黃苗無菌苗根部大約1 cm。然后于共培養(yǎng)3、12 和29 d 取樣，作為實驗組，未經(jīng)內生真菌侵染的作為空白組，提取總RNA，檢測地黃無菌苗中AOS 和OPR 基因在GG22侵染不同時間的表達特性。

1.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

采用Trizol試劑法（Thermo Fisher Scientific）提取上述不同樣品總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性。前期課題組對內生真菌GG22 侵染地黃后的轉錄組研究發(fā)現(xiàn)，GG22接種后期，地黃中AOS和OPR的表達量最高，因此，我們以GG22接種29 d 的樣品作為克隆目的基因的模板，參照TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）說明書進行cDNA第一鏈合成。

1.3 目的基因的克隆

將地黃cDNA稀釋5倍，作為模板，使用表1中特異引物進行擴增。反應體系為cDNA 2.0μL，2×Es Taq mix 10.0 μL，正反向引物各1.0 μL，ddH2O 6.0 μL，反應體系總體積為20.0 μL。反應程序：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，35 個循環(huán)；72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物并回收目的條帶。將回收的片段與pMD19-T 載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，經(jīng)過藍白班選擇挑選陽性克隆后送測序驗證。

1.4 生物信息學分析

使用ORF finder（http：//www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html）進行開放閱讀框查找；使用BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列的同源性搜索；使用Protparam（http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）預測蛋白的分子量等理化性質；使用SinalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測蛋白信號肽；使用TMpred（https：//embnet. vital-it. ch/software/TMPRED_form.html）預測蛋白跨膜區(qū)；使用NPSA server（http：//npsa-pbil. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat. pl？ page=npsa_sopm.html）預測蛋白二級結構，使用PSORT（https：//www.psort.org/）預測蛋白亞細胞定位；使用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）預測蛋白功能域；使用NetPhos 3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預測蛋白磷酸化位點；使用MEGA6.0 構建系統(tǒng)和進化樹，使用DNAMAN 進行多序列比對。

1.5 實時熒光定量PCR

根據(jù)基因序列，使用Primer5.0 設計特異性定量PCR 引物。以TIP41 基因為內參基因，利用SYBR Green 染料法，分析目的基因在不同地黃組織（根、葉和花）以及內生真菌侵染前后的基因表達特性。反應體系：SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、正反向引物各0.4 μL、QN Rox Reference Dye 0.1μL、ddH2O 7.1μL、模板cDNA 2μL。擴增條件：95℃20 s；95℃1 s；56℃20s；95℃1 s。40個循環(huán)。65～95℃進行熔解曲線分析，根據(jù)熔解曲線判斷產(chǎn)物的特異性，反應結束后，根據(jù)得到的Ct值，利用2-ΔΔCt，分別計算不同組織的表達量。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

2 結果與分析

2.1 總RNA的提取及目的基因的克隆

取4μL 的總RNA 經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，電泳結果顯示提取的RNA條帶比較清晰，具有18S 和28S 兩條清楚的條帶，表明所提取的RNA完整性比較好。

以內生真菌GG22侵染29 d的地黃葉片cDNA為模板，進行PCR擴增，采用凝膠電泳檢測PCR的結果，均擴增出約1 700 bp的目的條帶。測序結果表明，其核苷酸序列與轉錄組庫中序列一致，經(jīng)ORF Finder 分析，二者均包含有一個與目的基因大小一致的完整的開放閱讀框。其中RgAOS 基因ORF 長度為1 626 bp，編碼541 個氨基酸。利用在線軟件SMART 對其進行功能域預測，結果表明該基因編碼蛋白被注釋為CYP450超蛋白家族，保守域位于第366 位至第524 位。進一步序列分析表明，其歸屬于P450 超基因家族中的CYP74A 亞族。其序列具有以下結構域：①高度保守的I-Helix Region；②具有P450超基因家族中CYP74A亞族高度保守的ETLR 結構域；③具有高度保守序列血紅素結合結構域。

RgOPR 基因ORF 長度為1 197 bp，編碼398個氨基酸。利用在線軟件SMART 對其進行功能域預測，結果表明該基因編碼蛋白被注釋為古老黃酶超蛋白家族，保守域位于第12 位至第363 位。進一步序列分析表明，其序列具有以下結構域：①12-oxophytodienoate reductase 活性位點；②OYE 家族FMN 結合域；③2，4-二烯酰輔酶A 還原酶或相關的NADH 依賴性還原酶活性位點；④古老黃酶的酵母蛋白和來自大腸桿菌的FadH（2，4-二烯酰CoA還原酶活性位點。

2.2 目的基因氨基酸序列特征分析

RgAOS 蛋白分子量為60.20 kD，等電點為9.06。親水性的總平均值GRAVY 為-0.232，推測該蛋白為親水性蛋白。SignalP 結果表明該蛋白沒有信號肽。利用TargetP 在線預測軟件推測該蛋白可能定位在線粒體中。用SOPMA 預測蛋白質二級結構，結果顯示該蛋白由40.67%的α 螺旋（Alpha helix），4.62%的β 轉角（Beta turn），14.79%的延伸主鏈（Extended strand）和39.93%的無規(guī)則卷曲（random coil）構成。

RgOPR 蛋白分子量為44.07 kD，等電點為7.72。RgOPR 蛋白編碼398個氨基酸，親水性的總平均值GRAVY 為-0.269，推測該蛋白為親水性蛋白。利用TargetP 在線預測軟件推測該蛋白可能定位在細胞質中。用SOPMA 預測蛋白質二級結構，結果顯示該蛋白由34.67%的α 螺旋、17.09%的延伸鏈、10.30%的β-轉角、37.94%的無規(guī)卷曲構成。

2.3 目的基因同源進化分析

從NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載芝麻（Sesamum indi?cum）、水曲柳（Erythranthe guttata）、油橄欖（Olea europaea var.sylvestris）、番薯（Ipomoea nil）、美花煙草（Nicotiana sylvestris）、野生煙草（Nicotiana atten?uata）、野生種潘那利番茄（Solanum pennellii）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、番茄（Solanum lycopersi?cum）、紅薯（Ipomoea batatas）、貓耳朵（Dorcoceras hygrometricum）、金銀花（Lonicera japonica）、月季（Rosa chinensis）、野草莓（Fragaria vesca subsp. ves?ca）、檸檬辣椒（Capsicum baccatum）、辣椒（Capsi?cum annuum）、黃燈籠辣椒（Capsicum chinense）、毛茸煙草（Nicotiana tomentosiformis）、雷蒙德氏棉花（Gossypium raimondii）、陸地棉（Gossypium hirsu?tum）、梅花（Prunus mume）等物種中AOS 蛋白的氨基酸序列。利用MEGA6 軟件將上述下載的氨基酸序列與RgAOS蛋白的氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹。根據(jù)進化樹結果顯示，RgAOS 與雙子葉植物胡麻科植物芝麻SiAOS 親緣關系比較近，他們處于進化樹的同一個分支上。

報道顯示OPR 蛋白對催化的底物具有偏好性，基于結合底物的特異性可將其劃分為OPRⅠ和OPRⅡ兩大類，其中OPRⅡ催化形成JA。從NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載芝麻（S.indicum）、紫花風鈴木（Handroanthus impetiginosus）、合瓣花（Erythranthe guttata）、油橄欖（O.europaea var.sylvestris）、旋蒴苣苔（Dorcoceras hygrometricum）、毛萼香茶菜（Isodon eriocalyx）、獼猴桃（Actinidia chinensis var.chinen?sis）、山茶（Camellia sinensis）、木薯（Manihot escu?lenta）、鼠尾草（Salvia splendens）、潘那利番茄（S.pennellii）、伊德斯種咖啡（Coffea eugenioides）、野生煙草（Nicotiana attenuata）、馬鈴薯（Solanum tu?berosum）、番茄（S.lycopersicum）、小果咖啡（Coffea arabica）、裂葉牽牛（Ipomoea nil）、蓖麻（Ricinus communis）、茸毛煙草（Nicotiana tomentosiformis）、辣椒（C.chinense）、漿果狀辣椒（Capsicum bacca?tum）、東方苔草（Trema orientale）、美花煙草（N.syl?vestris）、葡萄（Vitis vinifera）、榴蓮（Durio zibethi?nus）、麻風樹（Jatropha curcas）、普通煙草（Nicotia?na tabacum）、棉花子（Gossypium arboreum）等物種中的OPRⅡ蛋白氨基酸序列，利用MEGA6 軟件將上述下載的氨基酸序列與RgOPR蛋白的氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹。根據(jù)進化樹結果顯示，RgOPR 蛋白與其他OPRⅡ蛋白親緣關系較近，推測其可能參與JA 的生物合成。RgOPR 蛋白與紫葳科植物紫花風鈴木HiOPR 和胡麻科植物芝麻SiOPR的親緣關系較近。

2.4 組織表達特性分析

利用實時熒光定量PCR 法，分析目的基因在地黃不同組織中表達特性。由圖3知，RgAOS基因在地黃3 個組織中均有表達，其在根中表達量最高，葉中次之，而花中最少。

由圖3可知，RgOPR基因的表達模式與RgAOS不同，其地黃3 個組織中的表達也有一定差異，其表達量在葉中最高，花次之，在根中的表達量最低。且花和葉中的表達量較接近，遠高于根中的表達量。

2.5 地黃組培苗受GG22侵染后的差異表達

利用實時熒光定量PCR 法，分析目的基因在GG22 侵染不同時間的表達特性。如圖4 所示，RgAOS 基因的表達在內生真菌GG22 侵染后發(fā)生了變化。在侵染初期，RgAOS 基因的表達有少許降低，而在侵染的中期、后期，其表達量均較對照組顯著增加，且在侵染29 d 時的地黃苗中的表達量最高。在內生真菌GG22 侵染的不同階段的表達量也不相同。在GG22侵染3 d時，其表達量與未接菌對照組差異不大，而在侵染12和29 d時，接菌組表達量均高于對照組。基于以上表達分析，我們推測，RgAOS 和RgOPR 基因均能響應內生真菌GG22的侵染，繼而引發(fā)后續(xù)茉莉酸類物質的積累。

3 討論

茉莉酸類物質是一種普遍存在于植物中的重要次級代謝產(chǎn)物，而且作為一類植物激素，其對植物的生長發(fā)育、逆境脅迫等方面起著關鍵的調控作用［27～28］，因此對JAs 在植物體內生物合成途徑相關基因的挖掘及分析，有助于從分子水平了解該類基因在植物發(fā)育、系統(tǒng)防御及次生代謝調控中的作用。

丙二烯氧化物合酶（allene oxide synthase，AOS）是茉莉酸類物質合成途徑中的第一個限速酶。對AOS 基因擬南芥敲除突變體與野生型都給予傷害處理，1 h 后野生型的內源JA 上升100 倍，而突變體的內源JA 無變化［29］。在擬南芥和煙草中過表達AOS 基因，給予傷害后，茉莉酸的含量高出未轉化植株的2～3 倍［30］。這些均說明AOS 基因在擬南芥內源JA 合成過程中發(fā)揮著重要作用。OPR 屬于古老黃酶（Old Yellow Enzyme，OYE）家族，擬南芥OPR 缺失的突變體中，JA 合成功能缺失，但其在傷誘導下可致使OPDA 積累，這說明OPR 是催化OPDA 形成JA 的過程中必不可少的關鍵酶。由于AOS 基因和OPR 基因在JA 生物合成途徑中的重要性，許多植物中二者已經(jīng)被克隆，并進行了功能分析，而關于地黃中AOS 基因和OPR基因的研究還未見報道。本研究首次克隆獲得了地黃茉莉酸生物合成關鍵酶基因RgAOS 和RgO?PR，其中RgAOS 基因序列全長為1 626 bp，編碼541 個氨基酸；RgOPR 基因序列全長為1 197 bp，編碼398個氨基酸。

研究表明，AOS 基因和OPR 基因表達均具有組織特異性。長春花CrAOS 基因在根中表達量最高，中期葉中次之，花中表達量最低［21］。而白木香AsAOS 基因在莖中表達量最高，根次之，葉中的表達量最少［12］。擬南芥AtOPR 在花器官中高表達。唐菖蒲GhOPR 在籽球和匍匐莖中表達量較高，在根中的表達量最低［31］。本研究表明，RgAOS 和RgOPR 的表達在不同和組織中存在差異，RgAOS基因的表達模式與長春花CrAOS 基因相似，在根中表達量最高，葉中次之，而花中最少。RgOPR 表達模式與唐菖蒲GhOPR 相似，均在根中的表達量最低，而在花中較高。

茉莉酸作為一種重要的植物激素，當植物遭受各種生物和非生物脅迫時，體內的茉莉酸類物質的積累發(fā)生變化。植物AOS基因和OPR 基因作為JA 生物合成的關鍵基因，當植物受到外界的各種生物和非生物脅迫時，其表達也會發(fā)生變化。如：低溫、鹽和鎘脅迫都誘導白木香AsAOS 基因的表達，而干旱脅迫對其表達影響較小［12］。長春花CrAOS 的表達可被機械損傷及低溫誘導［21］。玉米ZmOPR 基因受多種逆境如損傷、病原菌等脅迫的誘導［32］。霜霉病菌、機械傷害、低溫和熱激脅迫均能誘導不結球白菜BcOPR 基因表達［33］。本課題組從地黃不同部位分離出了一系列內生真菌中，經(jīng)初篩和復篩后發(fā)現(xiàn)，內生真菌GG22能夠明顯增加地黃梓醇及毛蕊花糖苷等次生代謝產(chǎn)物的含量。通過進一步比較內生真菌GG22 侵染前后地黃無菌苗轉錄組的差異發(fā)現(xiàn)，地黃RgAOS 和RgOPR 基因在GG22 侵染后表達量顯著增加。本研究在前期基礎上，利用實時熒光定量PCR 技術分析了二者在GG22 侵染不同時間的表達特性，結果發(fā)現(xiàn)，接種GG22 第12 天后，RgAOS 和RgOPR 基因的表達均被誘導。結合前期次生代謝產(chǎn)物的研究結果，我們推測，當內生真菌GG22 侵染地黃無菌苗后，JAs 生物合成關鍵酶RgAOS 和RgOPR 被誘導，導致JAs含量的積累，從而同啟動植物抗逆基因的表達，導致地黃中次生代謝途徑的變化，使梓醇及毛蕊花糖苷等次生代謝的合成加速。在以后的研究中，我們可以利用本研究克隆的RgAOS 和RgO?PR 基因，構建單一基因或雙基因的過表達或基因敲除的轉基因材料，測定轉基因材料中茉莉酸類物質的含量，從而推測RgAOS 和RgOPR 基因在茉莉酸類物質生物合成中的作用。進一步檢測轉RgAOS和RgOPR基因的地黃中次生代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，進一步明確茉莉酸類物質在地黃次生代謝產(chǎn)物合成中的調控作用。