外源ATP對油菜幼苗耐寒性的影響

胡馨丹 李 瑤 張小花 梁娟紅 張騰國

（西北師范大學生命科學學院，蘭州 730070）

低溫是限制植物生長的關鍵非生物脅迫之一，是影響植物生長發(fā)育、地理分布和作物產(chǎn)量的重要環(huán)境因子［1］。植物在受到低溫脅迫后會導致芽發(fā)育不良、葉片萎黃或泛黃以及組織死亡［2］。同時，在低溫脅迫過程中，植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量活性氧（ROS），當生成量超過植物自身的清除能力時，ROS 開始攻擊生物大分子，例如膜脂質、核酸和蛋白質，引起生物膜系統(tǒng)的損傷，導致光合產(chǎn)物的減少，代謝異常以及植物中有毒物質的大量積累［3～5］。耐寒性是植物抵御冷害的必要特性，特別是對于越冬作物［6］。為了增強植物在各種生物和非生物脅迫中的生命力，植物已經(jīng)進化出一套復雜且精細的抗氧化系統(tǒng)抵御外部環(huán)境脅迫，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、愈創(chuàng)木酚過氧化物酶（POD）和抗壞血酸過氧化物酶（APX），以及其他自由基清除劑。除此之外，植物在響應低溫脅迫過程中，各種有機和無機物質（如無機鹽、脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖和可溶性蛋白）通過滲透調(diào)節(jié)積累在植物細胞中，從而導致細胞液濃度增加和滲透勢降低，進而減緩低溫脅迫［7］。同時，Ca2+也參與耐寒調(diào)控過程，CPK 是Ca2+傳感器，可以感知Ca2+單個蛋白質中的水平和激酶活性，對植物發(fā)育和植物對各種環(huán)境脅迫的反應至關重要。研究表明，Ca2+依賴性蛋白激酶（CPKs）參與低溫脅迫下水稻的信號響應過程［8］。

ATP（三磷酸腺苷）不僅是所有生物的通用能源，而且還在細胞間通訊中充當重要的信號分子。20 世紀70 年代ATP 已被廣泛接受為介導眾多動物細胞過程的信號分子，包括神經(jīng)傳導、免疫應答、細胞生長和細胞死亡［9］。1970 年以后發(fā)現(xiàn)了ATP 在植物中可能發(fā)揮重要作用，Lew［10］等人發(fā)現(xiàn)外源施用ATP 可以促進根毛生長，并使生長中的根毛的質膜電位去極化；外源ATP 處理會引起根卷曲，并刺激側根生長［11］。隨著人們不斷地研究發(fā)現(xiàn)，ATP 參與植物生長和發(fā)育的各種生理過程，包括植物生長，生物/非生物脅迫響應［12］。研究表明，外源施用或內(nèi)源誘導的ATP 能夠增強植物對鹽［13］、寒 冷［14］、干 旱［15］等 非 生 物 脅 迫 的 抗 性。Feng［16］等研究發(fā)現(xiàn)，外源ATP 能夠增強菜豆幼苗的葉綠素熒光參數(shù)。擬南芥中，外源ATP 能夠通過清除ROS 促進根毛生長，表明ATP 能夠調(diào)節(jié)與植物形態(tài)發(fā)生有關的氧化還原平衡［17］。此外，細胞外ATP（eATP）對植物的免疫響應具有一定的濃度依賴性，適宜濃度的eATP 能夠增強植物對逆境的抗性［18～20］。Ca2+和H2O2是植物響應環(huán)境刺激誘導信號轉導途徑中的第二信使，也在外源ATP 調(diào)節(jié)植物細胞的生理功能中起作用。在應激信號轉導過程中，Ca2+和H2O2與ATP之間既相互獨立又存在交互作用［21］。研究表明，細胞外ATP 誘導的ROS 產(chǎn)生參與了各種植物的生長、發(fā)育和脅迫反應，例如防御反應，氣孔運動和程序性細胞死亡［22～23］。ATP 通過調(diào)節(jié)Ca2+以及CaM 基因的表達進而增強枇杷的耐低溫能力［24］；Ca2+和H2O2參與了外源ATP 對菜豆葉片的葉綠素熒光的調(diào)控［16］；外源ATP 能夠通過增加H2O2和Ca2+濃度進而增強胡楊細胞的耐鹽性［13］。雖然關于外源ATP 對植物抗逆性方面的研究有很多，但外源ATP 對油菜幼苗耐寒性方面的研究鮮見報道。

油菜作為我國第一大油料作物，其生產(chǎn)以冬油菜為主，但我國北方旱寒區(qū)冬季氣候寒冷，嚴重影響了冬油菜在我國北方地區(qū)的種植［25］，白菜型冬油菜“隴油7 號”（Brassica campestris L.）是可以在中國北方安穩(wěn)越冬的超強抗寒的冬油菜品種。本實驗以“隴油7 號”為材料，探究了外源ATP 對低溫脅迫下油菜幼苗丙二醛（MDA）、滲透調(diào)節(jié)物及活性氧的積累，光合能力以及抗氧化系統(tǒng)的影響，以及外源ATP 對低溫脅迫下油菜幼苗RBO?HD、RBOHF、CPK4、CPK5 基因表達的影響，同時，還研究了Ca2+和H2O2是否參與了外源ATP緩解低溫脅迫過程。研究結果為深入了解外源ATP 在植物抗逆過程中的生物學功能提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗以白菜型冬油菜“隴油7 號”為實驗材料，種子由甘肅農(nóng)業(yè)大學提供。

1.2 實驗設計與處理

挑選出顆粒飽滿，大小均一的油菜種子消毒后播種于裝有等量混合營養(yǎng)土（營養(yǎng)土∶蛭石=2∶1）的花盆，置于25℃、光照強度為150 μmol·m-2·s-1、光周期16 h/8 h（光照/黑暗）的培養(yǎng)間培養(yǎng)至4 周，挑選生長良好且長勢一致的油菜幼苗進行以下處理：①低溫脅迫：將油菜幼苗置于4℃的低溫培養(yǎng)箱中處理24 h；②ATP+低溫復合處理：用去離子水分別配置濃度為25μmol·L-1的ATP 溶液均勻噴灑在油菜幼苗葉片后，將油菜幼苗置于4℃條件下的低溫培養(yǎng)箱處理24 h；③CaCl2/EGTA/H2O2/DMTU+低溫復合處理：分別配制CaCl2（10 mmol·L-1）、EGTA（5 mmol·L-1）、H2O2（10 mmol·L-1）、DMTU（40 mmol·L-1）處理液分別均勻噴灑在油菜幼苗葉片后，將油菜幼苗置于4℃的低溫培養(yǎng)箱中處理24 h；④DMTU/EGTA+ATP+低溫復合處理：分別用40 mmol·L-1DMTU（H2O2清除劑）、5 mmol·L-1EGTA（鈣離子螯合劑）浸泡油菜根部12 h 后，洗凈油菜根部處理液，然后用去離子水配置的濃度為25 μmol·L-1的ATP 溶液均勻噴灑在經(jīng)抑制劑處理過的油菜幼苗上，再將油菜幼苗轉入4℃的低溫培養(yǎng)箱中處理24 h。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 總葉綠素含量的測定

總葉綠素含量的測定采用Knudson［26］的方法。

1.3.2 葉綠素熒光參數(shù)測定

參 照Demmig-Adams 等［27］的方 法 使 用PAM-2500葉綠素熒光儀測定葉綠素熒光參數(shù)。

1.3.3 生理指標測定

MDA含量的測定參照Heath［28］的方法；脯氨酸含量的測定參照Bates［29］的方法稍作改動；可溶性糖含量的測定參照郝建軍等［30］的方法；O2-含量的分布采用NBT 組織化學染色法［31］，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用NBT 顯色法測定［32］；過氧化物酶（POD）活性的檢測采用愈創(chuàng)木酚法［33］測定；過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法測定［24］；抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定參照Nakano［34］的方法測定；采用試劑盒測定總抗氧化酶（TAOC）活性和Ca2+-ATP 酶（Ca2+-ATPase）活性（購自南京建成生物工程研究所的試劑盒）。

1.3.4 實時熒光定量PCR 分析RBOHD、RBOHF、CPK4、CPK5基因表達

油菜葉片總RNA 的提取和cDNA 第一條鏈的合成，參照MiniBEST Plant RNA Extraction Kit（Code No.9769）試劑盒（TaKaRa 公司）中的說明書進行。以提取到的油菜總RNA 為模板，以ActinF和ActinR 為管家基因引物，RBOHD-F、RBOHD-D為RBOHD 引物，RBOHF-F、RBOHF-D 為RBOHF引 物，CPK4-F、CPK4-R 為CPK4 引 物，CPK5-F、CPK5-R 為CPK5 引物，參照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ定量試劑盒（TaKaRa 公司）的說明書進行RT-PCR 反應，所有基因特異引物（見表1）由華大基因科技有限公司合成。每個樣品均做3個平行，采用2?ΔΔCt法，其中：

式中：Ct 為熒光信號到達設定閾值時所經(jīng)歷的循壞數(shù)，計算基因相對表達量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析，按單因素方差分析法在P＜0.05 水平上進行顯著性檢驗，使用GraphPad Prism 5.01軟件制圖。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 Real-time PCR primers

2 結果與方法

2.1 外源ATP 對低溫脅迫下油菜幼苗的積累及抗氧化酶活性的影響

如圖1B-E 所示，與CK 相比，油菜幼苗葉片經(jīng)外源ATP 處理后，SOD、POD、CAT、APX 四種抗氧化酶的活性無明顯變化，經(jīng)低溫（4℃）處理24 h后，SOD、POD、CAT、APX 4 種抗氧化酶的活性顯著增加，分別增加了63.9%、57.5%、88.9%、112.6%；與單獨低溫（4℃）處理相比，外源ATP+低溫（4℃）復合處理下，SOD、POD、CAT、APX 4 種抗氧化酶的活性分別增加了14.1%、31.3%、44.3%、39.7%；結果表明，外源ATP 預處理能增加低溫脅迫下油菜幼苗SOD、POD、CAT、APX 的活性，維持低溫脅迫下ROS的平衡，增強油菜的耐寒性。

2.2 外源ATP對低溫脅迫下油菜幼苗脯氨酸、可溶性糖含量的影響

如圖2 所示，與CK 相比，外源ATP 處理后油菜幼苗葉片內(nèi)的脯氨酸和可溶性糖的含量無顯著增加，低溫（4℃）處理24 h 后，油菜幼苗葉片內(nèi)的脯氨酸和可溶性糖的含量顯著增加，分別增加了51.9%、97.4%；與單獨低溫（4℃）相比，低溫（4℃）+ATP 復合處理下脯氨酸和可溶性糖的含量顯著增加，分別增加了40.2%、45.9%。結果表明，低溫脅迫能夠誘導油菜葉片滲透調(diào)節(jié)物質的顯著升高，外源ATP 可以進一步提高低溫脅迫下油菜葉片的滲透調(diào)節(jié)物質，增強油菜幼苗的耐寒性。

2.3 外源ATP 對低溫脅迫下油菜幼苗葉綠素熒光參數(shù)的影響

Fv'/Fm'反應的是光適應下PSII 最大光化學效率，Y（II）反映的是光下葉片實際光化學效率，ETR反應的是電子傳遞速率，qP是光化學淬滅系數(shù)，表示的是PSII 中處于開放狀態(tài)的反應中心所占比例。如圖3A-D 所示，與CK 相比，外源ATP 處理對油菜幼苗的Fv'/Fm'、Y（II）、ETR、qP無明顯影響，但經(jīng)低溫（4℃）處理24 h 后油菜幼苗的Fv'/Fm'、Y（II）、ETR、qP 顯 著 下 降，分 別 下 降 了34.5%、21.1%、36.9%和45.3%；與單獨低溫（4℃）相比，低溫（4℃）+ATP 復合處理下油菜幼苗的Fv'/Fm'、Y（II）、ETR、qP 分別升高54.8%、15.6%、36.9%和67.5%，且均差異顯著。Y（NPQ）反應的是調(diào)節(jié)性能量耗散量子產(chǎn)量，NPQ 反映的是非光化學淬滅系數(shù)。如圖3E、F 所示，與CK 相比，外源ATP 處理對油菜幼苗的Y（NPQ）、NPQ 無明顯影響，但經(jīng)低溫（4℃）處理24 h 后油菜幼苗的Y（NPQ）、NPQ 顯著增加，分別增加了88.5%、25.7%；與單獨低溫（4℃）相比，低溫（4℃）+ATP 復合處理下油菜幼苗的Y（NPQ）、NPQ 分別下降了31.8%、67.5%，且均差異顯著。結果表明，外源ATP 預處理能夠緩解低溫脅迫下油菜幼苗光化學反應效率的降低。

2.4 外源ATP 對低溫脅迫下油菜幼苗丙二醛和總葉綠素含量的影響

如圖4A所示，與CK相比，低溫（4℃）處理24 h后油菜幼苗MDA 含量顯著升高；經(jīng)ATP 預處理再低溫（4℃）脅迫與單獨低溫（4℃）處理相比油菜幼苗MDA 含量降低了21.2%；與ATP+低溫（4℃）復合處理相比，用ATP+DMTU 預處理后在低溫脅迫處理的黃瓜幼苗MDA 含量增加了22.7%，用ATP+EGTA 預處理后在低溫脅迫處理的黃瓜幼苗MDA含量增加了19.4%，且均差異顯著，說明低溫脅迫能夠促進油菜幼苗MDA 含量增加，而外源ATP 預處理可以抑制低溫脅迫下油菜幼苗MDA 含量增加，緩解低溫脅迫下油菜幼苗的膜脂損傷，而DMTU 和EGTA 可以抑制外源ATP 對低溫脅迫下油菜幼苗膜脂損傷的緩解。

如圖4B所示，與CK 相比，低溫（4℃）處理24 h后油菜幼苗總葉綠素含量顯著降低；經(jīng)ATP 預處理再低溫（4℃）脅迫與單獨低溫（4℃）處理相比油菜幼苗總葉綠素含量升高了127.6%；與ATP+低溫（4℃）復合處理相比，用ATP+DMTU 預處理后在低溫（4℃）脅迫處理的黃瓜幼苗總葉綠素含量降低了26.7%，用ATP+EGTA 預處理后在低溫（4℃）脅迫處理的黃瓜幼苗總葉綠素含量降低了32.6%，且均差異顯著，說明低溫脅迫能夠導致油菜幼苗總葉綠素含量降低，外源ATP 預處理可以促進低溫脅迫下油菜幼苗總葉綠素含量增加，緩解低溫脅迫下油菜幼苗的損傷，而DMTU 和EGTA 可以抑制外源ATP 對低溫脅迫下油菜幼苗損傷的緩解，表明H2O2和Ca2+可能參與了ATP 誘導油菜幼苗的耐寒性的過程。

2.5 外源ATP 對低溫脅迫下油菜幼苗RBOHD、RBOHF基因表達和總抗氧化酶活性的影響

如圖5A、B 所示，單獨低溫（4℃）處理下，油菜幼苗RBOHD 和RBOHF 基因表達顯著上調(diào)分別是CK的2.32倍、3.53倍；與單獨低溫（4℃）處理相比，低溫（4℃）+ATP 復合處理下和低溫（4℃）+Ca2+復合處理下油菜幼苗RBOHD 和RBOHF 基因表達顯著上調(diào)，而低溫（4℃）+EGTA 復合處理下RBOHD和RBOHF 基因表達明顯下調(diào)；表明外源ATP 和Ca2+預處理均能夠增強低溫誘導下油菜幼苗RBO?HD和RBOHF基因表達；與低溫（4℃）+ATP處理相比，經(jīng)低溫（4℃）+ATP+EGTA 復合處理后油菜幼苗RBOHD 和RBOHF 基因表達顯著下調(diào)，說明外源ATP 對低溫脅迫下油菜幼苗的RBOHD 和RBO?HF基因表達的影響可能與Ca2+有關。

如圖5C 所示，與單獨低溫（4℃）處理相比，外源ATP 預處理再低溫（4℃）脅迫與Ca2+預處理再低溫（4℃）脅迫均顯著提高了T-AOC 酶活性，而經(jīng)EGTA 預處理后再進行低溫（4℃）脅迫，T-AOC 酶活性顯著降低；與低溫（4℃）+ATP 復合處理相比，低溫（4℃）+EGTA+ATP 復合處理顯著降低了油菜幼苗的T-AOC 酶活性，說明外源ATP 對低溫脅迫下油菜幼苗的T-AOC 酶活性的影響可能與Ca2+有關。

2.6 外源ATP 對低溫脅迫下油菜幼苗CPK4、CPK5基因表達和Ca2+-ATPase活性的影響

如圖6A～B 所示，單獨低溫（4℃）處理下，油菜幼苗的CPK4 和CPK5 基因表達顯著上調(diào)，分別是CK 的4.28、6.94 倍；與單獨低溫（4℃）處理相比，經(jīng)外源ATP 預處理或H2O2預處理再低溫（4℃）脅迫能夠誘導油菜幼苗CPK4和CPK5基因表達顯著上調(diào)，而低溫（4℃）+DMTU復合處理下CPK4和CPK5的基因表達顯著下調(diào)，表明外源ATP 和H2O2均可以誘導低溫脅迫下油菜幼苗CPK4和CPK5基因表達；與低溫（4℃）+ATP 處理相比，低溫（4℃）+DMTU+ATP 處理后的油菜幼苗CPK4 和CPK5 基因的表達水平顯著下調(diào)。說明外源ATP 對低溫脅迫下油菜幼苗的CPK4和CPK5基因表達的影響可能與H2O2有關。

如圖6C 所示，與單獨低溫（4℃）相比，DMTU預處理后再低溫脅迫下的油菜幼苗Ca2+-ATPase酶活性顯著下降，而外源H2O2預處理在低溫脅迫明顯提高了油菜幼苗的Ca2+-ATPase 酶活性，與低溫（4℃）+ATP 復合處理相比，低溫（4℃）+EGTA+ATP復合處理顯著降低了油菜幼苗的Ca2+-ATPase酶活性。說明外源ATP 對低溫脅迫下油菜幼苗的Ca2+-ATPase酶活性的影響可能與H2O2有關。

3 討論

植物在遭受低溫脅迫時，會產(chǎn)生大量ROS，導致膜脂過氧化、蛋白質活性降低甚至喪失、代謝紊亂等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫能夠使櫻桃、番茄、油菜、水稻幼苗中抗氧化酶活性增強、滲透調(diào)節(jié)物質含量升高、MDA含量降低，導致植物受到損傷［35～37］。同時，Huo［15，38］等研究發(fā)現(xiàn)，外源ATP能夠通過調(diào)節(jié)MDA 含量、抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質含量，進而增強非生物脅迫下植株幼苗的耐受性，本實驗結果與這些報道相一致。本研究發(fā)現(xiàn)，外源ATP能夠顯著抑制低溫脅迫下油菜幼苗MDA含量的增加、促進脯氨酸、可溶性糖含量的積累和SOD、POD、CAT、APX 活性的升高，表明外源ATP能夠通過調(diào)節(jié)低溫脅迫下油菜幼苗的滲透調(diào)節(jié)物質和抗氧化能力緩解質膜損傷，增強油菜幼苗的耐寒性。

光合作用是大多數(shù)植物正常生長發(fā)育的必要條件，逆境脅迫能夠導致植物葉綠素的合成以及有機物積累能力下降，造成植物產(chǎn)量降低甚至絕產(chǎn)。在本研究中，低溫脅迫下油菜幼苗的Fv'/Fm'、Y（Ⅱ）、ETR、qP參數(shù)顯著低于對照處理，Y（NPQ）、NPQ 參數(shù)明顯高于對照處理。這與低溫脅迫對水稻、黃瓜、甘蔗、香蕉等植株光合作用相關參數(shù)的影響相一致［39～40］。此外，也有研究表明，外源ATP處理能顯著提高病原菌感染下菜豆幼苗的光合速率［41］。本研究中，外源ATP 能提高低溫脅迫下Fv'/Fm'、Y（Ⅱ）、ETR、qP參數(shù)，降低低溫脅迫下Y（NPQ）、NPQ 參數(shù)，表明外源ATP 能夠通過調(diào)節(jié)低溫脅迫下油菜幼苗光合色素積累和光合效率的提高，進而提高油菜幼苗的耐寒性。

Ca2+和H2O2作為植物激素信號和植物對逆境應激反應過程中的信號分子，響應低溫和鹽等非生 物 脅 迫［42～43］。植 物NADPH 氧 化 酶 被 認 為 是H2O2的主要生產(chǎn)者，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫能夠誘導油菜幼苗RbohC和RbohF基因的表達［44］；外源ATP 通過刺激NADPH 氧化酶緩解水楊酸誘導的細胞死亡［45］。結合這些前人結果，本研究中，DMTU 預處理顯著降低外源ATP 對低溫脅迫下油菜幼苗MDA 含量的抑制和總葉綠素含量的增加，可能是由于H2O2參與外源ATP 對油菜幼苗耐寒性調(diào)控過程。CPK 是Ca2+傳感器，感知Ca2+單個蛋白質中的水平和激酶活性，對植物生長發(fā)育和應對各種環(huán)境脅迫至關重要。OsCPKs 能被低溫脅迫迅速激活，是水稻響應低溫脅迫過程中的必需基因［46］。同時，Jeter［47］等研究發(fā)現(xiàn)，外源ATP 能夠誘導擬南芥幼苗Ca2+濃度的增加。本研究表明，EGTA 預處理顯著降低外源ATP 對低溫脅迫下MDA含量的抑制和總葉綠素含量的增加，可能是由于Ca2+參與外源ATP 對油菜幼苗耐寒性調(diào)控過程。本實驗中，EGTA 或DMTU 預處理油菜幼苗均能降低外源ATP 對低溫脅迫下T-AOC 酶、Ca2+-ATPase酶的活性和RBOHD、RBOHF、CPK4 和CPK5 基因的表達，這與前人研究結果相一致［48～49］。以上結果表明Ca2+和H2O2均參與外源ATP 誘導油菜耐寒性的調(diào)控過程，并通過Ca2+和H2O2依賴性機制影響油菜幼苗的耐寒性。

4 結論

外源ATP 能夠提高低溫脅迫下油菜幼苗葉綠素含量、滲透調(diào)節(jié)物質含量、抗氧化酶活性、降低MDA 含量，進而保護細胞膜系統(tǒng)免受膜質損傷。Ca2+和H2O2均能參與外源ATP 對低溫脅迫下油菜幼苗的調(diào)控過程，并通過Ca2+和H2O2依賴性機制影響油菜幼苗的耐寒性。