低溫脅迫下紅松與西伯利亞紅松光合與氣孔特性

王 芳 陸志民 王 君 張世凱 李峪曦 李紹臣 張建秋 楊雨春*

（1. 吉林省林業科學研究院，長春 130000；2. 東北林業大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040）

溫度是影響林木生長發育的重要因素，對林木生長發育起至關重要的作用。林木只有在最適溫度條件下才能表現出最大產量，如果生存溫度過高或者過低，林木生長的新陳代謝及生理過程均會發生變化［1］。目前，國內外關于低溫脅迫的研究越來越詳細，逐漸由低溫脅迫下表型、生理生化向分子研究轉變。在諸多體現低溫脅迫的生理指標中，光合作用是最先，也是最容易測定的指標之一，也是判斷植物抗逆性強弱的重要因素［2］。在低溫脅迫下，低溫可以降低植物光合過程中相關酶活性，導致光合速率下降［3］，但由于應對不同脅迫溫度與脅迫時間［4］，植物生長與生理指標可表現較大差異。

紅松（Pinus koraiensis）與西伯利亞紅松（Pinus sibirica）是中國東北以及俄羅斯等寒溫帶地區生長的重要頂級群落樹種，對其研究較多，重點在良種選育［5］、木材特性［6］、育苗技術［7］、生態效益［8］、分子結構［9］等，而對于紅松與西伯利亞紅松光合特性研究較少［10］。20 世紀80 年代，紅松曾大量引種至大興安嶺北坡寒冷地區，但由于抗寒性較差，全部死亡［11］，之后在東北林業大學科研團隊的帶領下，大興安嶺林區大量引種西伯利亞紅松，至今已經開花、結實、育苗，表明大興安嶺北坡等寒冷地區引種西伯利亞紅松是可行的，也表明西伯利亞紅松與紅松的抗低溫能力具有較大差異，西伯利亞紅松較紅松具有更強的耐寒性。為探討低溫脅迫下紅松與西伯利亞紅松的生理響應機制及抗寒生理機理，本實驗室對紅松和西伯利亞紅松幼苗的質膜透性、超氧化物歧化酶、可溶性糖等10個生理指標進行測定，發現紅松與西伯利亞紅松幼苗在高于-40℃的低溫脅迫下植株均可正常生長，各指標均體現一定的變化趨勢，而-60℃和-80℃時2 個樹種幼苗均已冰凍致死［12］?；谝陨涎芯勘尘?，本研究以西伯利亞紅松和紅松為實驗材料，對低溫脅迫下（高于-40℃的低溫）幼苗的光合特性、氣孔特性進行測定分析，進一步探究低溫脅迫下兩樹種間的光合指標、氣孔特性及形態等變化情況，為紅松以及西伯利亞紅松抗寒研究提供理論依據。

1 實驗材料與實驗方法

1.1 實驗材料

紅松與西伯利亞紅松的種子分別來自中國吉林省龍井市（129°45′E，42°40′N）和俄羅斯新西伯利亞（82°55′E，55°2′N），新西伯利亞的年均溫、1月氣溫和7 月氣溫分別是0.2℃、-18.8℃和19.0℃［5］，龍井的年均溫、1 月氣溫和7 月氣溫分別是5.3℃、-13.4℃和21.2℃［13］。西伯利亞和龍井的最低溫分別是-60℃和-34.8℃［14］。2010 年采種，次年播種，4年后選擇生長健壯的紅松和西伯利亞紅松幼苗放在東北林業大學白樺強化種子園中進行培育。

1.2 實驗方法

本實驗設計3 個脅迫溫度（0℃、-20℃和-40℃）和3個脅迫時間（6、24和48 h），以20℃（室溫）為對照，共計10 個處理。各樹種在不同處理條件下分別以24株為實驗材料。低溫處理利用低溫光照培養箱（丙林SPX-800FT（-22℃～60℃））和海爾DW-40W380（-20℃～-40℃）進行，將栽植于容器內的幼苗直接放入相應的低溫儀器中處理，低溫處理后，恢復30 min 進行光合指標與氣孔性狀的測定。采用美國lico 公司生產的lico-6400 光合儀對不同單株第二輪枝條上的針葉進行各光合指標測定，測量時，光照強度和CO2分別設定為1 600μmol·m-2·s-1和400 μmol·mol-1，其他環境因子不進行控制，儀器輸出數據主要包括瞬時光合速率（Pn，μmol·m-2·s-1）、蒸騰速率（Tr，μmol·m-2·s-1）和氣孔導度（Gs，mol·m-2·s-1）等。氣孔的觀察采用掃描電鏡法，用NeoScope 型臺式掃描電鏡觀察不同處理的針葉并拍照。利用CellSens Entry 顯微圖像軟件測得氣孔密度、保衛細胞長寬度和氣孔開度等信息。

氣孔面積［15］=3.14×（保衛細胞長度/2×氣孔開度/2）

在對光合實驗結果進行處理的過程中發現，-20℃時兩樹種的凈光合速率已出現負值，因此未對-40℃處理的苗木進行光合指標的測定。

2 結果與分析

2.1 不同處理下光合特性的t檢驗

t 檢驗結果見表1。在室溫（20℃）和任一低溫處理條件下，各光合指標在紅松與西伯利亞紅松中的差異是顯著的（P＜0.05），表明紅松與西伯利亞紅松在正常狀態下和在應對低溫脅迫時的光合能力均具有顯著差異。

表1 不同處理條件下各光合指標的t檢驗Table 1 t test of each photosynthetic index under different treatments

2.2 紅松與西伯利亞紅松光合特性的方差分析比較

本研究以不同處理為變異來源，進行單因素方差分析（見表2）。紅松與西伯利亞紅松在不同處理條件下各測定指標差異均達極顯著水平（P＜0.01），表明低溫以及低溫脅迫時間對紅松與西伯利亞紅松各光合指標影響較大。

2.3 低溫脅迫下紅松與西伯利亞紅松的凈光合速率

不同處理條件下紅松與西伯利亞紅松凈光合速率見圖1，在室溫（20℃）條件下，紅松與西伯利亞紅松凈光合速率Pn分別為14.65和11.95μmol·m-2·s-1，隨著溫度降低與脅迫時間的延長，這兩個樹種凈光合速率均呈顯著下降趨勢，在0℃處理條件下，2個樹種穩步下降，但是在-20℃處理條件下，紅松凈光合速率急劇下降，脅迫6 h 后平均凈光合速率只有0.66 μmol·m-2·s-1，在脅迫24 與48 h 均達負值。西伯利亞紅松在-20℃處理后6 h 平均凈光合速率顯著高于紅松，達到3.81μmol·m-2·s-1，在脅迫24 h后平均凈光合速率也在0 以上（0.34μmol·m-2·s-1），在脅迫48 h后達到負值。

2.4 低溫脅迫下紅松與西伯利亞紅松的氣孔導度

不同處理條件下，紅松與西伯利亞紅松氣孔導度Gs見圖2。在室溫（20℃）條件下，紅松與西伯利亞紅松Gs分別為0.682 和0.589 mol·m-2·s-1，隨著溫度降低與脅迫時間的延長，這兩個樹種Gs均呈顯著下降趨勢。在0℃處理條件下，2 個樹種的Gs均隨著低溫脅迫時間的延長穩步下降，變化范圍分 別 為0.506～0.291 mol·m-2·s-1和0.386～0.208 mol·m-2·s-1，但是在-20℃處理條件下，紅松Gs急劇下降，脅迫6 h 后平均Gs只有0.036 mol·m-2·s-1，在脅迫24 與48 h 分別為0.029 和0.028 mol·m-2·s-1。西伯利亞紅松在-20℃處理后6 h 平均Gs比紅松高3.75倍，達到0.135 mol·m-2·s-1，在脅迫24與48 h的Gs分別為0.022和0.018 mol·m-2·s-1。

表2 不同處理條件下紅松與西伯利亞紅松各光合指標的方差分析Table 2 Variance analysis of photosynthetic indices of P.koraiensis and P.sibirica under different treatments

2.5 低溫脅迫下紅松與西伯利亞紅松的蒸騰速率

不同處理條件下紅松與西伯利亞紅松蒸騰速率Tr見圖3。在室溫（20℃）條件下，紅松與西伯利亞紅松蒸騰速率Tr分別為2.485和2.096μmol·m-2·s-1，隨著溫度降低與脅迫時間的延長，這兩個樹種Tr均呈顯著下降趨勢。在0℃處理條件下，2 個樹種穩步下降，變化范圍分別為1.840～1.154 和1.408～0.816μmol·m-2·s-1。在-20℃處理條件下，紅松Tr急劇下降，脅迫6 h 后平均Tr只有0.144μmol·m-2·s-1，在脅迫24與48 h分別為0.117和0.114μmol·m-2·s-1。西伯利亞紅松在-20℃處理后6 h平均Tr是紅松的3.67倍，達到0.529 μmol·m-2·s-1，在脅迫24 與48 h 的Tr分別為0.089和0.072μmol·m-2·s-1。

2.6 氣孔特性的t檢驗

5 個氣孔特性相關指標的t 檢驗結果見表3。紅松的氣孔密度與西伯利亞紅松的氣孔密度差異顯著（P＜0.05），保衛細胞長、保衛細胞寬、氣孔開度和氣孔面積在紅松與西伯利亞中差異不顯著。

2.7 紅松與西伯利亞紅松氣孔特性比較的方差分析

各氣孔特性相關指標的雙因素方差分析見表4。不同溫度條件下，紅松與西伯利亞紅松氣孔開度與氣孔面積差異均達極顯著水平（P＜0.01），其余各指標差異均未達顯著水平。不同時間或不同的溫度×時間的互作對各指標沒有顯著影響，差異不顯著。因此以下僅研究了不同溫度下紅松與西伯利亞紅松形態和特征。

表3 各氣孔特性指標的t檢驗Table 3 t test of each stomatal character index

表4 紅松和西伯利亞紅松氣孔各測定指標的雙因素方差分析Table 4 Two-way ANOVA of each index for P.koraiensis and P.sibirica

2.8 不同低溫脅迫下紅松與西伯利亞紅松的氣孔形態及特征

脅迫前紅松與西伯利亞紅松的氣孔均為橢圓形（見圖4：A，E），隨著溫度的降低，紅松與西伯利亞紅松針葉氣孔呈現相同變化趨勢，從對照20℃到0℃、-20℃，氣孔開度均顯著下降，-40℃與-20℃氣孔開度差異不顯著。低溫脅迫下紅松與西伯利亞紅松具體氣孔特性見表5。處理前后氣孔密度變化不大，沒有顯著差異，紅松與西伯利亞紅松變化范圍分別為2.0×10-4～2.4×10-4（個·μm-2）和2.0×10-4～2.1×10-4（個·μm-2），紅松的氣孔密度顯著大于西伯利亞紅松（見表3）；從保衛細胞來看，隨著溫度的降低，保衛細胞長度和寬度則沒有顯著差異，紅松與西伯利亞紅松保衛細胞長度變化范圍分別為42.63～45.95μm 和43.06～45.10μm，保衛細胞寬度變化范圍分別為30.58～32.92 μm 和25.12～28.16 μm；低溫對紅松和西伯利亞紅松氣孔開度以及氣孔面積影響較大，隨著低溫脅迫的加強，紅松氣孔開度變化范圍為6.07～12.54μm，20℃處理條件下紅松氣孔開度是-40℃處理條件下的2.07倍；西伯利亞紅松氣孔開度的變化范圍為5.83～13.44μm，20℃處理條件下西伯利亞紅松氣孔開度是-40℃處理條件下的2.31倍；低溫脅迫下紅松與西伯利亞紅松氣孔面積急劇下降，紅松與西伯利亞紅松氣孔面積變化范圍分別為212.15～421.38μm2和196.56～452.92μm2，最大值分別為最小值的1.99和2.30倍。

表5 不同溫度脅迫下紅松與西伯利亞紅松的氣孔特征Table 5 Stomatal characteristics of P.koraiensis and P.sibirica under different temperature stress

3 討論

光合作用是植物生長和發育最重要的生理指標之一，高光合速率一般會增加植物同化二氧化碳和水的能力，最終產生高生物量［16］。本研究中脅迫前紅松中的各光合指標均顯著高于西伯利亞紅松，紅松與西伯利亞紅松凈光合速率分別為14.65 和11.95 μmol·m-2·s-1，與王曼［10］對二者之間的光合速率測定結果不同，原因可能是由于材料與測定環境不同造成的，王曼利用的是樟子松為砧木的嫁接苗，同時測定環境為室外，而本研究采用的是實生苗，在室內進行的光合測定實驗，測定儀器所要求的環境因子控制的更理想。0℃的低溫處理后，紅松與西伯利亞紅松中的各光合指標穩步下降，但紅松中各光合指標值仍顯著高于西伯利亞紅松，說明0℃對兩個樹種是一個相對較弱的低溫［12］。

隨著低溫脅迫的加重，紅松與西伯利亞紅松各光合指標值顯著降低，-20℃時急劇下降，表明低溫對二個樹種均產生較強影響，這與劉偉對黃瓜（Cucumis sativus L.）［17］、須海榮對茶樹（Camellia si?nensis L.）［3］、陳劍成對凹葉厚樸（Magnolia officina?lis subsp.biloba）［18］的研究結果相同。由于光合作用不僅與植物自身葉綠體結構有關，還與光合磷酸化、光合電子傳遞、暗反應相關的酶活性有關，低溫不僅影響這些酶的活性，還可能造成光合機構的損傷［19］，本研究也再一次證明低溫脅迫下紅松與西伯利亞紅松各生理指標逐漸降低的合理性［12］。低溫脅迫下紅松與西伯利亞紅松氣孔導度和蒸騰速率與光合速率變化規律相近，都是逐漸降低，且紅松中各光合指標的含量高于西伯利亞紅松，但在-20℃處理6 h 時，西伯利亞紅松的凈光合速率、蒸騰速率與氣孔導度顯著高于紅松，表明在瞬間低溫處理條件下，西伯利亞紅松抵御低溫的能力比紅松強，這可能是西伯利亞紅松抗寒性比紅松強的間接因素之一，具體原因需要進一步研究。

氣孔是由保衛細胞構成的，是直接影響植物葉片光合作用的細胞器，其會隨著溫度的高低呈現開放與閉合的狀態［20］。溫度變化可以影響氣孔運動，當溫度過高或者過低時，氣孔會趨向關閉并引起氣孔導度的變化，進一步影響植物的蒸騰速率和凈光合速率［21］。本研究中紅松中的氣孔密度顯著高于西伯利亞紅松，而氣孔長、氣孔寬、氣孔開度和氣孔面積無顯著差異，這可能是導致室溫（20℃）和較弱的低溫（0℃）下紅松中的凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率顯著高于西伯利亞紅松的原因之一。紅松與西伯利亞紅松在低溫脅迫后，氣孔開放程度明顯下降，表明低溫脅迫后，紅松與西伯利亞紅松會依靠大量生理代謝反應來降低脅迫帶來的危害［22］，這也是這兩個樹種自我保護的體現。本研究中紅松與西伯利亞紅松光合速率下降、氣孔導度降低除了與低溫脅迫下各種酶活性能力下降有關以外［12］，氣孔開放程度的降低也是重要因素之一。

總之，從低溫脅迫下光合指標與氣孔性狀來看，紅松與西伯利亞紅松均形成系統的自我保護機制，但西伯利亞紅松抗寒能力比紅松稍強，這與二者其余生理指標研究結果相同［12］，下一步研究應以低溫脅迫下兩樹種的分子機理研究為主，融合轉錄組、代謝組以及蛋白質組的測定與分析，切實為紅松與西伯利亞紅松的良種選育提供技術支撐。